Цветан Велинов: Човешки микробиом

Цветан Велинов, УМБАЛ „Александровска“ ЕАД

Кореспонденция: Доц. д-р Цветан Велинов, д.м., Началник на Централна лаборатория по микробиология, УМБАЛ „Александровска“ ЕАД, ЦЛМ, бул. „Св.         Георги Софийски“ № 1, 1431 София; E-mail: tzv@mail.bg

Резюме

Човешкото тяло е дом за огромен брой микроорганизми (археи, микроскопични гъбички, протозои и вируси), които обитават кожата и лигавиците на здрави нормални хора и формират „нормалната микробиота“ на организма. Геномите на тези микросимбионти колективно се дефинират като „микробиом“. Изчислява се, че на всяка човешка клетка се падат по десет микробни клетки, а гените, които носят тези микроорганизми, превишават човешките 150 пъти. Малка част от тази популация са патогенните микроорганизми. Друга, по-голяма част, са условно патогенните микроорганизми. Третият вид бактерии са „добрите“ или полезните за човека и животните бактерии. Най-голямо е количеството на тези бактерии, както и биоразнообразието им в стомашно-чревния тракт, но и други части на тялото, като белите дробове, не са лишени от присъствието на микроорганизми. Съвременните изследвания показват, че нормалната микробиота осигурява първа линия на защита срещу различни патогени, подпомага разграждането на редица вещества в организма, играе роля в деградацията на токсините и допринася за узряването на имунната система. Комплексността и стабилността на микробиома е полезна за макроорганизма, като го предпазва от чужда колонизация, осигурява хранителни вещества, енергия, витамини, късоверижни мастни киселини, обучава имунната система. Стареенето, стресът, неправилният начин на живот, грешки в диетата, както и употребата на някои лекарства, най-вече антибиотици, водят до нарушаване на естествения баланс на микрофлората на човека.

Ключови думи: микробиом, микробиота, респираторен тракт

Откритието на А. ван Льовенхук през 1683 г., че в тялото ни има микроби, е много изненадващо и безспорно е предизвикало огромен интерес и вълнение сред учените от 17-ти век. Оттогава тези наши спътници не са преставали да ни изненадват. Първо, те станаха причина за страх, тъй като имат потенциал да причинят редица болести, някои от които (като менингит и пневмония) – животозастрашаващи. На по-късен етап открихме, че това са и коменсали, които трябва да ценим и пазим, защото са от съществено значение за нашето развитие, участват в защитата ни от екзогенни патогени и ни доставят хранителни вещества, енергия и витамини. Сега, през второто десетилетие на 21-ви век, узнаваме, че те участват и в изграждането на физиката ни, определят поведението и настроението ни. Развитието на взаимоотношенията ни с микрофлората доведе до разбирането, че ни чакат още много изненади.

Познанието за микробите, с които съжителстваме, се увеличи значително през последните години. Индикатор за интереса, който проявяваме към тази популация, са публикациите в PubMed: през 2017 г. бяха публикувани повече от 7000 студия, почти осем пъти повече от 2000 г.

Какво е обяснението за този нарастващ интерес към човешката микрофлора и микробиологията в частност? Изглежда две са движещите сили: на първо място, това е повишеният интерес към важността на микробиома за човешкото развитие, хранене, поведение, здраве и болест; на второ място, разработването на технологии, позволяващи да изучим не само количествения и видов състав на микрофлората, но и метаболизма й със съответното му влияние върху макроорганизма.

Отдавна е известно, че група от микроорганизми, познати като патогени, причиняват тежки инфекциозни болести. Други микроорганизми (част от нормалната ни флора) при определени обстоятелства могат да предизвикат различни болестни състояния – те са т.н. „условно патогенни“. Напоследък се натрупаха достатъчно доказателства за това, че голяма част от микроорганизмите, които ни обитават, играят важна роля за поддържането на човешкото здраве и благополучие. Тук искам да уточня някои термини:

· „Микробиота“ е качественият и количествен състав на микроорганизми, обитаващи една екологична ниша;

· „Микробиом“ е генетичната информация, която носят тези микроорганизми. В края на 19-ти и началото на 20-ти век много от членовете на това, което сега идентифицираме като собствена микробиота, се оказват причинители на редица инфекции, като примерите, представени в табл. 1.

Липсата на достатъчно познания по онова време какво представлява нормалната микрофлора определя тези микроби като патогени, а в действителност те присъстват, ако не при всички, то в голяма част от здравата човешка популация. При определени обстоятелства, както споменах по-горе, те могат да причиняват болест. Наскоро стана ясно, че не само отделни представители на нормалната ни микрофлора са способни да причинят болест, но и промяна в целостта й в дадено място (дисбиоза), също може да доведе до болест.

Още от дълбока древност се е подозирало значението на чревното съдържимо, както казва Хипократ „смъртта седи в червата; лошото храносмилане е корен за всяко зло.“ Към края на 19 век става ясно за много изследователи, че чревната микрофлора е важна за чревната физиология, а Пастьор през 1885 г. отива още по-далеч, като предполага, че животът на животните няма да бъде възможен при липса на местни микроби. През втората половина на миналия век се натрупват и много доказателства, че местната микрофлора не само допринася за здравето и благосъстоянието на бозайниците по редица начини, но също играе важна роля в развитието им. Това, че собствената микрофлора оказва защитен ефект чрез предотвратяване колонизацията от екзогенни патогени, е демонстрирано през 1962 г., когато се установява, че мишките са 100 000 пъти по-податливи на инфекция със S. enteritidis след прилагане на единична доза стрептомицин. Повече информация за ролята на микробите в развитието на бозайниците се получава чрез сравнителни проучвания между животни с и без нормална колонизация от микроорганизми, т.н. „Germ-free animals“. Като примери могат да се посочат промените, които се наблюдават при животни без микроорганизми: намалената маса на сърцето, белия дроб и черния дроб; увеличен размер на цекума (може да бъде осем пъти по-голям); намалена абсорбция на водата от дебелото черво; намалена концентрация на деконюгирани жлъчни соли; повишено рН на стомаха; намалена маса на тънките черва; липса на имунни клетки в lamina propria; намалена чревна перисталтика; намалена повърхност на чревната лигавица; намалява производството на IgG и IgA.

Разгадаването на локалната микрофлора като резервоар на микроорганизми, причиняващи болести, констатацията, че промените в цялостния й състав (т.е. дисбиозата) също могат да доведат до редица хронични болести, осъзнаването, че тя има важна роля за развитието и здравето на хората, и накрая, неотдавнашното признаване на способността й да влияе върху мозъчната функция и поведението ни, са основните движещи фактори за характеризирането на тази общност. Така описаните открития не биха били възможни без разработването и прилагането на редица нови техники за идентифициране на организмите, които присъстват в тези сложни общности, и за установяването на това, което те правят там. Пътят, който извървя науката, е дълъг и труден, от светлинния микроскоп и усъвършенстването му до електронния му събрат. Въвеждането на културелните методи (за да визуализираме съответните микроорганизми) и методите за идентификация (въвеждане на ред сред огромното множество) са първите стъпки, но те са насочени съвсем логично към тази микробна популация, която причинява инфекции сред хората. Така наречената „класическа микробиология“ се занимава именно с това – видовата и родовата идентификация на причинителите на инфекции и определяне чувствителността им към антимикробни средства. Така са натрупани базовите познания за част от състава на резидентната ни микрофлора. Например за дихателните пътища (ДП) – само горните им участъци (носа и фаринкса) имат резидентни микробни общности; по-ниските отдели изглежда са в голяма степен лишени от култивируеми микроби. Въпреки че доминиращите култивируеми организми в микробните съобщества в дихателния тракт са известни, точният им състав трудно може да се дефинира. Това се дължи донякъде и на факта, че дихателните пътища са място за пренасяне на някои много важни човешки патогени (Streptococcus pyogenes, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis и S. aureus) и следователно повечето бактериологични изследвания са фокусирани върху откриването на тези организми.

Използвайки дори и най-добрите методи на класическата микробиология, не можем да оценим напълно микробното разнообразие в различните екологични ниши. Причините за това са много и включват:

· недостиг или липса на хранителни вещества или екологични изисквания за част от микробите;

· наличието в организма ни на микроорганизми, които са жизнеспособни, но не могат да се култивират поради невъзможността да се сепарират различните видове от една съобщност (обитателите на биофилмите например);

· умирането на голяма част от микробите по време на транспортирането и обработката на пробите.

Всичките тези трудности доведоха до сериозно подценяване на броя и разнообразието на микроорганизмите в дадена екологична ниша, като всеобщото мнение е, че ние можем да изолираме не повече от 1-2% от микробните видове на Земята. След като са получени отделни изолати, следващата задача е да се идентифицират. Традиционно това включва използването на набор от морфологични, физиологични и метаболитни тестове, които са много трудоемки и често не са достатъчно дискриминационни. През последните години се наблюдава нарастваща тенденция да се използват молекулярно-генетични техники за идентифицирането на микроорганизмите и една от тях е секвениране на гените, кодиращи 16S rRNA¹¹. Генът се амплифицира чрез полимеразно-верижна реакция (PCR) и последователността на получената ДНК се определя и след това се сравнява с последователностите на 16S rRNA гени на организми, които са били депозирани в бази данни. Ако последователността е повече от 98% подобна на тази в базата данни, тогава се приема, че генът е от един и същи вид и следователно може да се установи самоличността на един неизвестен организъм. Процедурата е много по-лесна за изпълнение от класическите фенотипни тестове за идентификация и има огромно предимство, че позволява филогенетичното сравняване на отделните организми.

При микроскопичните гъбички рРНК генен комплекс се състои от четири рибозомални гена, кодиращи 18S (малка субединица), 5.8S и 28S (голяма субединица) и 5S. В рамките на тази област internal transcribed spacer (ITS) и D1/D2 региона на субединицата 28S (състояща се от около 600 нуклеотидни чифта), са най-филогенетично променливите участъци и широко се използват за идентификация и таксономия на гъбичките. Различни други техники също се използват за идентифициране и допълнително характеризиране на изолираните микроби. Те включват електрофореза в пулсово поле (PFGE), риботипиране, мултиплекс PCR, arbitrary primed PCR, MALDITOF-MS (matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) и др.

Колонизирането ни с микроорганизми започва още от раждането, а според някои проучвания и преди това. Като цяло сме наясно, че нормалната ни микробна флора се променя във времето. Веднага след раждането колонизацията е предимно от бифидобактерии и лактобацили при раждане „per viasnaturales” и преимуществено с представители на кожната флора при „sectio caesarea“¹². С преминаването към твърди храни разнообразието от клостридийни видове се увеличава. След втората година, микробната флора се стабилизира, състои се основно от представители на семействата Bacteroidaceae, Lachnospiraceae и Ruminococcaceae¹³. Така микробиома достига своята сложност през юношеската възраст и остава относително стабилен до зрялата възраст. В по-късните етапи от живота микробиомът става сравнително по-малко разнообразен, с намалена стабилност. Днес съществуват сериозни доказателства в подкрепа на наследствения характер на микрофлората. Въпреки че наследството на бактериите от бащата е слабо проучено, увеличаващите се доказателства подкрепят наследството от майката¹⁴.

Тъй като лактобацилите доминират във влагалището на майката, първоначалното колонизиране на стомашно-чревния тракт с тези бактерии не може да е случайно. Друг важен фактор за състава на микробиома е начинът на хранене, тъй като флората на бебетата, хранени с кърма в сравнение с тези на изкуствено хранене, е много различна, както по отношение на състава, така и по отношение на разнообразието. Бифидобактериите присъстват в микрофлората на кърмачетата, докато при бебета, хранени с изкуствени храни, преобладават Escherichia coli, Clostridium difficile, Bacteroides fragilis и лактобацили¹⁵.

Промените в микробиома, свързани с напредване на възрастта, водят до понижена стабилност на екосистемите, като доминиращите семейства се изместват от представители на Firmicutes и Bacteroides, като се увеличават и представителите на протеобактериите за сметка на бифидобактерите. Един от най-важните фактори, влияещи върху състава на микробиома, е употребата на антибиотици. Тези лекарствени средства унищожават патогенните бактерии, но оказват огромно влияние и върху останалата, нормална микробна флора. Въздействието им е строго индивидуално и до голяма степен зависи от честата и/или скорошна употреба на антибиотици. Например, 1-2 седмица след лечение с ципрофлоксацин, чревната микрофлора може да се възстанови напълно, докато при едноседмична терапия с клиндамицин, антибиотик със значително антианаеробно действие, въздействието му може да продължи до две години след приключване на терапията¹⁶.

Различни флуктоации в така стабилизирала се флора често се наблюдават при напредване на възрастта, при преминаването на друг диетичен режим, при болестни състояния, когато се налага терапия с различни лекарствени средства (предимно с антибиотици) и др. Много проучвания от последните години подкрепиха с доказателства горното твърдение. Изследвани са вариациите на микробиома, взети от различни места в тялото на здрави индивиди в четири различни времеви точки¹⁷. Има данни и за структурата на микробните съобщества в червата и слюнката на индивиди, изследвани в продължение на една година, като са наблюдавани промени, свързани с начина на живот на тези хора (диетичен режим обогатен с фибри)¹⁸. Тези промени са настъпили не чрез придобиването на нови бактериални видове, а чрез промени в количествения състав на съществуващите микробни групи, главно чрез двойно увеличение на съотношението Bacteroides към Firmicutes. При сравняване на чревното съдържимо на европейски деца с това на деца от село в Буркина Фасо са установени драстични разлики, дължащи се на различните диетични режими в двете популации.

Тези данни доказват, че микробната ни популация е много приспособима. Разбира се, тя е повлияна от характера на екологичната ниша, която обитава, и етапа на развитие на гостоприемника, но в същото време начинът на живот на индивида и въздействието на околната среда могат да предизвикат промени в състава и количеството й. Промените или различията в структурата на микробиота не са непременно дисбиоза, те са поскоро доказателство за приспособимостта, гъвкавостта на флората ни е и напълно съвместима със здравето.

При изучаването на човешката патофизиология е критично да се има предвид не само всеки представител в екосистемата, но симбиозата и взаимоотношенията между отделните екосистеми (най-вече червата и останалите). Скорошен доклад демонстрира важността на тази връзка при пациенти с алогенна трансплантация на хематопоетични стволови клетки (allo-HSCT), които имат увреда на стомашно-чревната лигавица, водеща до намалено разнообразие на чревната флора. Това поставя въпроса за въздействието на чревното разнообразие върху смъртността след трансплантация. Охарактеризирани са бактериални 16S rRNA ген ни последователности и микробното разнообразие е оценено чрез индекса на Simpson. Субектите са класифицирани в групи с високо, средно и ниско разнообразие. Резултатите от смъртността са значително по-лоши при пациенти с по-ниско чревно разнообразие; общата преживяемост от 3 години е съответно 36%, 60% и 67% за групите с ниско, средно и голямо разнообразие. Авторите на тази студия сочат разнообразието на чревната микрофлора като независим предиктор за смъртността при алогенна трансплантация на хематопоетични стволови клетки¹⁹.

Дихателната система, както и всички други органи и системи в организма ни, е екологична ниша за множество коменсални микроорганизми. За разлика от гастроинтестиналния тракт тук разнообразието и количеството микроорганизми е значително по-малко, като биомасата намалява от горните към долните ДП. Въпреки че колонизирането на горните ДП (особено назофарингеалната област) от потенциални патогени, индуцира заболявания само при малък брой индивиди, тя представлява важен източник на секрети, съдържащи микроби, които се разпространяват между индивидите. Колонизацията на горните ДП е променлива и зависи от редица фактори. Например при децата от значение е възрастта, броят на братята и сестрите, участието в социален живот, диета, остри инфекциозни болести; докато при възрастните от по-голямо значение са хроничните болести, затлъстяването, имуносупресията, алергични състояния и пр. Сезонността също е фактор, който влияе на флората във всяка възраст. През есента и зимата, които са свързани с повишена честота на респираторни инфекции, се наблюдават преобладаващо представители на Proteobacteria и Fusobacteria. През пролетта обаче Bacteroidetes и Firmicutes са по-честите обитатели. Друг компонент на назофарингеалния микробиом са вирусите. Около 30% от всички предполагаеми вирусни инцидента годишно не могат да се диагностицират с конвенционалните тестове. Тук на помощ ни идва метагеномиката, посредством която можем да открием познати или нови вируси. По този начин някои автори предлагат да се дефинира „проекта на човешкия виром“– системно изследване за вируси, които заразяват хората, с потенциал за откриване на нови патогени, и предлагат модел за всеобхватна диагноза на необясними остри инфекциозни състояния. Случаят с грипния вирус H1N1 от 2009 г., показа, че тази стратегия има потенциал да замени конвенционалните диагностични тестове.

Долните ДП се състоят от различни анатомични области, от които бронхоалвеоларното пространство остава най-добре проучено. Вземането на проби от бронхоалвеоларното пространство чрез бронхоалвеоларен лаваж (БАЛ) остава важен инструмент за поставяне на клинични диагнози. Проблем остава фактът, че глобалната микробна картина, предоставена ни от БАЛ, маскира регионалните разлики в ДП. В тази връзка е доказано, че разликите в микроархитектурата на ДП на белите дробове водят до пространствено отделни бактериални общности²⁰. В цитираното проучване авторите добиват проби от множество отделни места в белия дроб при пациенти с ХОББ. Интересното е, че микробната съобщност в горните отдели на белите дробове са доминирани от Haemophilus spp. Благодарение на високото съдържание на кислород в тези области се създава и благоприятна среда за развитието на гореспоменатите бактерии, които се свързват и с екзацербациите на ХОББ. От друга страна, бактериите се нуждаят и от хранителни вещества за развитието си (генериране на енергия и клетъчна биосинтеза). Към сегашния момент познанията ни за източниците на хранителни вещества, необходими за оптимален бактериален растеж, са ограничени. Проучванията, изследващи биохимичните профили на ендогенните метаболити с ниско молекулно тегло, присъстващи в издишания въздух, храчките и пробите от БАЛ, при болни и здрави хора, могат да ни дадат информация за възможните източници на енергия, присъстващи в ДП. При болни с муковисцидоза се установява, че бионаличността на лактат, валин, таурин и аланин е по-висока в сравнение със здрави контроли²¹. Други възможни източници на енергия в ДП са бронхиалната слуз, която е богата на гликолипиди и гликопротеини, както и  белодробният сърфактант. Понастоящем има малко данни за това как метаболитите на ДП оформят белодробната микрофлора, но това е важна област за бъдещи изследвания.

В развитието на микробната флора на дихателните пътища можем да разгледаме няколко важни момента. На първо място това е вътрематочната микробна експозиция. Новопоявили се данни показват, че вътрематочната среда, смятана преди това за стерилна, съдържа уникална микрофлора и поставя въпроса за развитието на бебешката микробиoта преди раждането²². Установено е, че амниотичната течност, която играе съществена роля в белодробната и чревната органогенеза, съдържа различни микробни съобщества²³. Натрупаните доказателства за връзката между изолирането на микоплазми и уреаплазми от амниотичната течност и некротизиращия ентероколит при новородените ни кара да мислим, че вътрематочната микробна композиция може и играе важна роля в постнаталния живот. След раждането бактериите, получени от околната среда, значителна част от които са от майчин произход, колонизират повърхностите на тялото. Както бе споменато и по-горе, начинът на родоразрешение е от ключово значение за първичната колонизация на новороденото.

Както вече стана ясно, ДП са дом за голямо количество микроби, чийто състав, както и въздействието им върху здравето на дихателните органи, едва сега започва да се изяснява. Използвайки различни техники за бактериално идентифициране, се установи, че здравите ДП при възрастни съдържат до 2000 микроорганизма/cm3 тъкан²⁴. Сравнявайки микробиомите на ДП при пациенти с муковисцидоза, ХОББ, астма и реципиенти на белодробна трансплантация, се наблюдават забележителни различия, както помежду си, така и в сравнение със здрави контроли. Най-разпространените родове, намерени в „нормалните“ ДП, включват Pseudomonas (Proteobacteria), Streptococcus (Firmicutes), Prevotella (Bacteroides), Fusobacteria, Veillonella, Haemophilus²⁵.

Послания за клиничната практика

1. Настоящите доказателства твърдо подкрепят важната роля на микрофлората при регулирането на ДП.

2. Нашите познания за ключовите фактори в ранния живот, които водят до създаването на стабилна микрофлора в белите дробове, и взаимодействието им с имунните клетки остават ограничени.

3. Докато в червата микроорганизмите използват различни хранителни компоненти като енергийни източници, с освобождаване на метаболитни продукти, способни да модулират локален и системен имунен отговор, белите дробове са лишени от такива богати енергийни източници и поради това е вероятно местните микробни видове да са развили способността да използват алтернативни източници на енергия, намиращи се в ДП. В момента липсват доказателства за такива алтернативни енергийни източници. Това е интригуваща област на по-нататъшни изследвания, които да ни посочат какви източници на енергия в ДП са необходими по време на здраве или болест и могат да бъдат основа за нови стратегии за лечение на различни белодробни болести.

Литература

1. Turnbaugh PJ, Hamady M, Yatsunenko T et al. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature 2008; 457: 480–4.

2. Suzaki H, Watanabe S, Pawankar R. Rhinosinusitis and asthma — microbiome and new perspectives. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2013; 13: 45–9.

3. Dickson RP, Erb-Downward JR, Huffnagle GB. The role of the bacterial microbiome in lung disease. Expert Rev Respir Med 2013; 7: 245–57.

4. Ege MJ, Mayer M, Normand A C et al. Exposure to environmental microorganisms and childhood asthma. N Engl J Med 2011; 364: 701–9.

5. Hsiao EY, McBride SW, Hsien S et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 2013; 155: 1451–63.

6. Bringiotti R, Lerardi E, Lovero R et al. Intestinal microbiota: The explosive mixture at the origin of inflammatory bowel disease? World J Gastrointest Pathophysiol 2014; 5: 550–9.

7. Berer K, Mues M, Koutrolos M et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature 2011; 479: 538–41.

8. Wu X, Ma C, Han L et al. Molecular characterisation of the faecal microbiota in patients with type II diabetes. Curr Microbiol 2010; 61: 69–78.

9. Zaura E, Nicu EA, Krom BP, Keijser BJ. Acquiring and maintaining a normal oral microbiome: current perspective. Front Cell Infect Microbiol. 2014; 4: 85.

10. Louis P, Hold GL, Flint HJ. The gut microbiota, bacterial metabolites and colorectal cancer. Nature Revs Microbiol 2014: 12; 661–672.

11. Wilson M. The human-microbe symbiosis. In: Bacteriology of humans: an ecological perspective. Oxford:Wiley Blackwell, 2008; 1–55.

12. Dominguez Bello MG, Costello EK, Contreras M et al. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial microbiota across multiple body habitats in newborns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 2010; 107: 11971–5.

13. Arrieta MC, Stiemsma LT, Amenyogbe N, Brown EM, Finlay B. The intestinal microbiome in early life: health and disease. Front Immunol 2014; 5: 427.

14. Ochman H, Worobey M, Kuo CH et al. Evolutionary relationships of wild hominids recapitulated by gut microbial communities. PLoS Biol 2010; 8: e1000546.

15. Penders J, Thijs C, Vink C et al. Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy. Pediatrics 2006; 118: 511–21.

16. Jernberg C, Lofmark S, Edlund C et al. Long-term impacts of antibiotic exposure on the human intestinal microbiota. Microbiology 2010; 156: 3216–23.

17. Costello EK, Lauber CL, Hamady M, Fierer N, Gordon JI, Knight R. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science 2009; 326: 1694–1697.

18. David LA, Materna AC, Friedman J, et al. Host lifestyle affects human microbiota on daily timescales.Genome Biol 2014; 15: R89.

19. Taur Y, Jenq RR, Perales MA et al. The effects of intestinal tract bacterial diversity on mortality following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2014; 124: 1174–1182.

20. Erb-Downward JR, Thompson DL, Han MK et al. Analysis of the lung microbiome in the “healthy”smoker and in COPD. PloS One 2011; 6: e16384.

21. Wolak JE, Esther CR, O’Connell TM. Metabolomic analysis of bronchoalveolar lavage fluid from cystic fibrosis patients. Biomarkers: biochemical Indicators of Exposure, Response, and Susceptibility to Chemicals 2009; 14: 10.1080/13547500802688194.

22. Moller BR, Kristiansen FV, Thorsen P et al. Sterility of the uterine cavity. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica 1995; 74: 216–9.

23. Mysorekar IU, Cao B. Microbiome in parturition and preterm birth. Semin Reprod Med 2014; 32:50–5.

24. Hilty M, Burke C, Pedro H et al. Disordered Microbial communities in asthmatic airways. PloS One 2010; 5: e8578.

25. Marsland BJ, Gollwitzer ES. Host-microorganism interactions in lung diseases. Nat Rev Immunol 2014; 14: 827–35.