Смисъл на броя: Разработване на прототип на мултиепитопна ваксина срещу SARS-CoV-2

Брой № 1 (74) / февруари 2024, Имунология за пулмолози

Използвани съкращения:

 

MHC – главен комплекс на тъканната съвместимост

HLA – човешки левкоцитни антигени

ORF – отворени рамки за прочитане

APC – антиген представящи клетки

MR – манозен рецептор

QM – количествени матрици

IEBD – база данни за имунни епитопи

SAAS – методи за единично аминокиселинно заместване

 

 

Вирусът, който ни уплаши, или поне повечето от нас – кой е той?

 

Тежкия остър респираторен синдром, причинен от коронавирус 2 (SARS-CoV-2) причини бързо развиваща се коронавирусна пандемия, стартираща през 2019 г. (COVID-19), която завладя системите на здравеопазване по целия свят. SARS-CoV-2 принадлежи към рода на β-коронавирусите, които включват SARS-CoV, който се появи през 2002 г., както и коронавируса, причинил Близкоизточния респираторен синдром (MERS-CoV), който се появи през 2012 г. Този род причинява тежки човешки заболявания, като към април 2023 г. СЗО отчита повече от 760 милиона случая на COVID-19 по света и 6,9 милиона смъртни случая1,2.

 

Клиничните прояви на COVID-19 варират в широки граници, проявяващи се от асимптоматична инфекция до остра дихателна недостатъчност и смърт, но основните механизми за тази висока вариабилност все още не са известни. По същия начин ролята на имунните отговори на гостоприемника при вирусното изчистване от COVID-19 остава нерешена. SARS-CoV-2 има 12 предполагаеми функционални отворени рамки за четене (ORF) и споделя 82% нуклеотидна хомология със SARS-CoV3. В SARS-CoV-2 има най-малко четири структурни протеина: Шип (S), Обвивка (E), Мембрана (M), Нуклеокапсид (N) (Фиг. 1).

 

 

 

Фиг. 1. Структура и геном на SARS-CoV-2

 

 

Тримерният S протеин се разцепва на S1, съдържащ рецепторния свързващ домен, и S2 субединици, като S2 допълнително се разцепва в S2‘. S протеинът е критичен за навлизането на вируса и е важна мишена за неутрализиране, както е при SARS-CoV и MERS-CoV. Този протеин е и ключова цел за диагностични тестове и разработване на ваксини. S1 субединицата на SARS-CoV-2 споделя около 70% идентичност със SARS-CoV, докато идентичността на S2 субединицата е до 99% с някои доказателства за кръстосана реактивност между вирусите. Освен тези структурни протеини, геномът на SARS-CoV-2 кодира около 20 предполагаеми неструктурни протеини. Обнадеждаващо е, че докладите показват, че пациентите със SARS-CoV-2 развиват неутрализиращи и висок титър S1-специфични антитела отговори, както и силни Т и В клетъчни отговори4.Въпреки това, мащабът на имунния отговор като производство на антителата изглежда е свързан с клиничната тежест на заболяването COVID-19. Тези случаи на слаб или никакъв отговор на специфични антитела чрез традиционните серологични подходи могат да доведат до подценяване на асимптомните и леки инфекции и да застрашат успеха на потенциална ваксина, която е насочена само към S1.

 

 

Да си направим ваксина, дали да не ползваме HLA … 

 

Ваксинацията е една от най-ефективните превантивни мерки срещу животозастрашаващи инфекциозни заболявания и умелото ѝ приложение драстично би подобрило общественото здраве. В момента 9 ваксини срещу COVID-19 са валидирани за употреба от СЗО, повече от 1000 кандидат-ваксини са в клинична и предклинична разработка.5 Разбирането на адаптивния имунитет към SARS-CoV-2 е важно за дизайна на ваксината, тълкуването на патогенезата на COVID-19 и калибрирането на мерките за контрол на пандемията. Първите стъпки за такова разбиране са способността да се определят количествено специфичните за вируса CD4+ и CD8+ Т-клетки. Такива знания са от непосредствено значение, тъй като биха предоставили представа за имунитета и патогенезата на инфекцията SARS-CoV-2 и същите знания биха подпомогнали дизайна на ваксината и оценката на кандидат-ваксините.

 

Системата на главния комплекс за тъканна съвместимост (MHC), известна като човешки левкоцитарен антиген (HLA) при хората, се намира на късото рамо на хромозома 6 и съдържа най-полиморфния генен клъстер от целия човешки геном. Освен това, HLA се състои от три региона, които са определени като клас I, клас II и клас III въз основа на структурата и функцията на генните продукти. Основната функция на HLA клас I генни продукти (HLA-A, -B и -C) е да представят ендогенни пептиди на реагиращите CD8+ Т-клетки, докато клас II кодираните молекули HLA-DR, -DP и –DQ имат ограничена експресия и обработват екзогенни пептиди за представяне на CD4+ хелперни Т-клетки. Чрез използването на HLA клас I и II прогнозирани пептидни „мегамиксове“, Grifoni и колектив6 успяха да идентифицират циркулиращи специфични за SARS-CoV-2 CD8+ и CD4+ Т-клетки, съответно в приблизително 70% и 100% от реконвалесцентните пациенти с COVID-19. Бяха наблюдавани стабилни CD4+ Т-клетъчни отговори към шиповия (S) протеин, който е основната цел на повечето усилия за разработване на ваксини, и беше установено, че корелира с нивата на анти-SARS-CoV-2 IgG и IgA антитела.

 

Мембранните (M), S и нуклеокапсидните (N) протеини съставляват 11 – 27% от общия CD4+ отговор и допълнителни отговори, насочени към nsp3, nsp4, ORF3a и ORF8. CD8+ Т-клетките разпознават S и М с най-малко осем таргетни ORF на SARS-CoV-2. Трябва да се отбележи, че SARS-CoV-2-реактивни CD4+ Т-клетки са открити при приблизително 40 – 60% от вирус-неекспонираните индивиди, което показва възможността за кръстосано реактивно Т-клетъчно разпознаване между циркулиращи човешки коронавируси на „обикновена настинка“ и SARS-CoV-2.

 

Протеините на човешкия левкоцитен антиген (HLA) съдържат специфично място за свързване (BS) за пептиди от различен произход, вкл. вирусен. BS има полиморфна архитектура и определя екстремния полиморфизъм на HLA алелите. Има повече от 25 000 HLA клас I и 10 000 HLA клас II алели, регистрирани в IPD-IMGT/HLA базата данни (април 2023 г.)7. Клиничният резултат от вирусните инфекции е свързан с HLA генотипа8-10. Тези HLA протеини, които създават стабилни и дълготрайни вирусно-пептидни комплекси и позволяват развитие на имунитет, базиран на Т-клетки, са свързани с лека тежест или дори резистентност към вирусна инфекция. Напротив, HLA протеините, които не успяват да направят комплекс с вирусни пептиди, са свързани с чувствителността и тежестта на вирусната инфекция. Вече са описани няколко връзки между HLA и текущата пандемия SARS-CoV-211-14.

 

Целта на нашето изследване е разработване на нова мултиепитопна ваксина от следващо поколение за превантивна терапия на SARS-CoV-2. Мултиепитопните ваксини се състоят от няколко HLA-ограничени епитопа, произхождащи от вирусни протеини и разпознаваеми от CD8+ и/или CD4+ Т-клетки15. Прототипът на мултиепитопната ваксина, проектиран в настоящото проучване, се очаква да генерира вирус-специфичен Т и/или В-клетъчен имунен отговор и да служи като in vivo валидиране на защитните свойства на базирана на наночастици мултиепитопна ваксина в хуманизиран ACE2-трансгенен миши модел. Тук описваме дизайна на прототип на мултиепитопна ваксина срещу SARS-CoV-2 на базата на имуногенни пептиди от основните структурни протеини – S, M, N и E, избрани от имуноинформационни модели и пригодени да бъдат активни при хуманизирани-ACE2 трансгенни B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J мишки.

 

 

Как намерихме различните вирусни епитопи за ваксината

 

За да изберем именно тези епитопи, които биха ни осигурили генерирането на универсална и стабилна във времето анти-SARS-CoV-2 ваксина, беше особено важно да зададем две предварителни условия. Първото е да открием кои са тези консервативни епитопи в 4-те базови вирусни протеина, които не се променят в резултат на генерираните мутации и развитието на вирусите. За тази цел по биоинформатичен път открихме епитопите, които не търпят промени както при SARS-CoV, така и при MERS-CoV. Второто условие е определено от принципа, че ние разработваме човешка ваксина, която обаче ще бъде тествана на мишки, което задължава откриването на такива епитопи, които припокриват мишите и човешките типове.

 

Епитопите, които да участват във ваксината, бяха избрани чрез молекулен доконг. За целта бяха използвани кристалографските структури на комплекси между пептиди и МНС протеини H2-Db (pdb код: 4L8D) [16], H2-Kb (pdb код: 3P9L) [17] и I -Ab (pdb код: 1MUJ) [18], налични в Protein Data Bank (https://www.rcsb.org) [19]. Пептидите в комплексите бяха използвани като родителски структури за изграждане на комбинаторни библиотеки по метода на единичното аминокиселинно заместване (SAAS). Комбинаторната пептидна библиотека за H2-Db включваше 172 пептида, библиотеката за H2-Kb – 153 пептида, а тази за I-Ab – 267 пептида. Три групи от пептиди с различна дължина, свързващи се с H2-Db, H2-Kb и I-Ab, бяха събрани от базата данни за имунни епитопи (IEDB) (https://www.iedb.org) [20] и използвани като тестови групи. Всеки пептид от комбинаторните библиотеки беше докнат в съответния MHC протеин и позата с най-ниска енергия беше отчетена. Молекулният докинг беше проведен с AutoDock Vina [21]. Енергиите на комплексите пептид-MHC бяха нормализирани по три начина: стандартна нормализация, нормализация за единица маса, включваща всички водородни атоми и нормализация за единица маса, включваща само полярните водородни атоми. Така бяха генерирани три количествени матрици (QM) за всеки алел. Матриците баха валидирани с трите тестови групи. Най-добра предсказваща способност за H2-Db и H2-Kb показаха матриците, нормализирани за единица маса с включени полярни водородни атоми, а за I-Ab – матрицата със стандартна нормализация. Тези матрици по-нататък бяха използвани за оценка на афинитета на пептидите, генерирани от протеините на SARS-CoV-2.

 

Майер и др. [22] са публикували списък с Т-клетъчни епитопи, произлизащи от S, M и E протеините на SARS-CoV-2, идентифицирани при реконвалесцентни пациенти с COVID-19. В настоящото проучване ние използвахме само епитопи, разпознати от поне трима пациенти. Афинитетът на тези епитопи към мишите MHC протеини беше оценен чрез докинг-матриците и бяха избрани тези, които показаха най-висок афинитет.  Единадесет пептиди от S, M, N и E протеините на SARS-Cov-2 бяха избрани за синтез и експерименти с животни. Пептидите бяха синтезирани с >98% чистота (Caslo Laboratory, Lyngby, Дания). Локализацията на избраните пептиди е показана върху протеините на SARS-Cov-2 (Фиг. 2).

 

 

Фиг. 2. Локализация на епитопите върху структурите на SARS-Cov-2 протеини. (A) Е протеин: YSFVSEETG (син) и TLIVNSVLLFLAF (червен). (B) M протеин: LSYYKLGAS (син) и LSYFIASF (червен). (C) N протеин: AQFAPSASAF (червен), WYFYYLGTGP (син), AGLPYGAN (зелен) и LALLLLDRL (жълт). (D) S протеин: QSYGFQPTNGV (червен), IPFAMQMAYRFNGI (син) и EFRVYSSANNCTFE (зелен). Протеините E, M и N са димери, а противоположните области съдържат същите епитопи (не са маркирани). Изображенията са генерирани от PyMOL Molecular Graphics System, версия 2.5.0.

 

 

Как доставяме вирусните епитопи в целевите клетки

 

Имунизацията с вирусните пептиди без никаква адювантна формация няма да доведе до желания ефект – доставяне на тези вирусни епитопи до имунната система и нейното активиране. Затова се търсят наночастици – доставчици, които да опаковат тези вирусни елементи. ISCOM са наночастици, съставени от холестерол, сапонин, фосфолипиди и съответния антиген23. ISCOM матрицата е ISCOM без антиген, където холестеролът, Quil A и фосфолипидите се самосглобяват в подобна на клетка структура. Идеята ни беше да конструираме два вида частици – кухи частици, които да опаковат хидрофобните вирусни пептиди в сърцевината си, както и плътни частици, които да интегрират допълнително добавената хидрофобна опашка към пептидите (Фиг. 3).

 

 

 

Фиг. 3. Синтез на пептидните епитопи от всеки вирусен протеин и включването им в кухи наночастици (A) или в плътни липидни частици (B)

 

 

Важен въпрос е как тези вече опаковани в наночастици вирусни епитопи ще проникнат в прицелните клетки и дали ще влязат и в други клетки. А кои са прицелните клетки – това са антиген-представящите клетки (APC), които инициират имунния отговор и са пряко отговорни за неговото протичане. Измежду тях са макрофагите – хетерогенна популация от клетки, присъстващи в много тъкани и органи. Характерна особеност за тези клетки е, че те експресират множество рецептори, които способсват тяхното активиране. Един такъв характерен рецептор е манозният рецептор (MR). За да насочим наночастиците, носещи вирусните епитопи директно и само към макрофагите, при формирането на наночастиците добавихме манозни остатъци, които да се свържат на повърхността и така да могат да бъдат разпознати от манозните рецептори. Активираните макрофаги ще фагоцитират наночастиците и ще обработят вирусните епитопи, попаднали в ендозомите (Фиг. 4).

 

 

Фиг. 4. Улавяне на наночастиците от манозните рецептори (MR) с последваща активация на макрофагите и представянето на пептидите от МНС комплекса 

 

 

След обработката в ендозомите вирусните пептиди се експортират през протеозомата и ендоплазматичния ретикулум към молекулите на МНС, които ги експресират на повърхността на клетката и активират хелперните Т-клетки, стартирайки процеса на специфичен имунен отговор.

 

 

В какви мишки ще тестваме ваксина, направена за хора

 

Най-важният елемент от дизайна на ваксината е подходящ избор на животински модел за тестване. Мишките не се разболяват от SARS-CoV-2, защото мишият ACE2 рецептор не се разпознава от вируса и той не може да проникне в клетката. Затова прототипът на ваксината беше тестван върху трансгенни B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J мишки. Трансгенният миши модел е разработен чрез вмъкване на човешки ACE2 ген в генома на C57B6 мишки. Този щам на мишка носи MHC клас I алели H2-Db и H2-Kb и MHC клас II алел I-Ab. Мултиепитопната ваксина е предназначена да съдържа пептиди, свързващи се с тези MHC алели. Схемата на ваксинация и патологичните параметри, които се проследяват по време на тестването, са показани на фиг. 5.

 

 

Фиг. 5. Схема на имунизация с наночастиците, носещи вирусни епитопи и параметри на анализ след изграждане на имунен отговор 

 

 

Резултатите от ваксинацията на опитните животни с новогенерираната мултиепитопна ваксина се анализират в момента и ще бъдат представени в следващи публикации.

 

Литература:

 

  1. Lurie N, Saville M, Hatchett R, Halton J. Developing Covid-19 Vaccines at Pandemic Speed. N Engl J Med. 2020;382(21):1969-1973. doi:10.1056/NEJMp2005630
  2. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. https://covid19.who.int/, April 2023.
  3. Wu F, Zhao S, Yu B, et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China [published correction appears in Nature. 2020 Apr; 580(7803):E7]. Nature. 2020; 579(7798):265-269. doi:10.1038/s41586-020-2008-3
  4. Ni L, Ye F, Cheng ML, et al. Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and Cellular Immunity in COVID-19 Convalescent Individuals. Immunity. 2020; 52(6):971-977.e3. doi:10.1016/j.immuni.2020.04.023
  5. Covid-19 – living NMA initiative. https://covid-nma.com/vaccines/mapping/, April 2023.
  6. Grifoni A, Weiskopf D, Ramirez SI, et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 2020;181(7):1489-1501.e15. doi:10.1016/j.cell.2020.05.015
  7. Barker DJ, Maccari G, Georgiou X, Cooper MA, Flicek P, Robinson J, Marsh SGE. The IPD-IMGT/HLA Database. Nucleic Acids Research (2023) 51:D1053-60
  8. Hill AV, Allsopp CE, Kwiatkowski D, et al. Common west African HLA antigens are associated with protection from severe malaria. Nature. 1991;352(6336):595-600. doi:10.1038/352595a0
  9. Carrington M, O‘Brien SJ. The influence of HLA genotype on AIDS. Annu Rev Med. 2003;54:535-551. doi:10.1146/annurev.med.54.101601.152346
  10. Thio CL, Thomas DL, Carrington M. Chronic viral hepatitis and the human genome. Hepatology. 2000; 31(4):819-827. doi:10.1053/he.2000.4316
  11. Nguyen A, David JK, Maden SK, et al. Human Leukocyte Antigen Susceptibility Map for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. J Virol. 2020;94(13):e00510-20. Published 2020 Jun 16. doi:10.1128/JVI.00510-20
  12. Wang W, Zhang W, Zhang J, He J, Zhu F. Distribution of HLA allele frequencies in 82 Chinese individuals with coronavirus disease-2019 (COVID-19). HLA. 2020;96(2):194-196. doi:10.1111/tan.13941
  13. Lorente L, Martín MM, Franco A, et al. HLA genetic polymorphisms and prognosis of patients with COVID-19. Polimorfismos genéticos de los HLA y pronóstico de pacientes con COVID-19. Med Intensiva (Engl Ed). 2021; 45(2):96-103. doi:10.1016/j.medin.2020.08.004
  14. Novelli A, Andreani M, Biancolella M, et al. HLA allele frequencies and susceptibility to COVID-19 in a group of 99 Italian patients. HLA. 2020;96(5):610-614. doi:10.1111/tan.14047
  15. Zhang L. Multi-epitope vaccines: a promising strategy against tumors and viral infections. Cell Mol Immunol. 2018;15(2):182-184. doi:10.1038/cmi.2017.92
  16. Valkenburg SA, Quiñones-Parra S, Gras S, et al. Acute emergence and reversion of influenza A virus quasispecies within CD8+ T cell antigenic peptides. Nat Commun. 2013;4:2663. doi:10.1038/ncomms3663
  17. Denton AE, Wesselingh R, Gras S, et al. Affinity thresholds for naive CD8+ CTL activation by peptides and engineered influenza A viruses. J Immunol. 2011;187(11):5733-5744. doi:10.4049/jimmunol.1003937
  18. Zhu Y, Rudensky AY, Corper AL, et al. Crystal structure of MHC class II I-Ab in complex with a human CLIP peptide: prediction of an I-Ab peptide-binding motif. J Mol Biol. 2003;326(4):1157-1174. doi:10.1016/s0022-2836(02)01437-7
  19. H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, et al. The Protein Data Bank (2000) Nucleic Acids Research 28: 235-242 doi:10.1093/nar/28.1.235.
  20. Vita R, Mahajan S, Overton JA, et al. The Immune Epitope Database (IEDB): 2018 update. Nucleic Acids Res. 2018 Oct 24. doi: 10.1093/nar/gky1006.
  21. Eberhardt J, Santos-Martins D, Tillack AF, et al. New Docking Methods, Expanded Force Field, and Python Bindings. J Chem Inf Model. 2021;61(8):3891-3898. doi:10.1021/acs.jcim.1c00203
  22. Meyers LM, Gutiérrez AH, Boyle CM, et al. Highly conserved, non-human-like, and cross-reactive SARS-CoV-2 T cell epitopes for COVID-19 vaccine design and validation. NPJ Vaccines. 2021;6(1):71. Published 2021 May 13. doi:10.1038/s41541-021-00331-6
  23. Zhao L, Seth A, Wibowo N, et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 2014; 32(3):327-37. doi: 10.1016/j.vaccine.2013.11.069. PMID: 24295808.

 

Вашият коментар