Смисъл на броя: Имуногенна регулирана клетъчна смърт в туморната система – смъртта е само началото

Използвани съкращения:

КС – клетъчна смърт

иРКС - имуногенна регулирана клетъчна смърт

РКС - регулирана клетъчна смърт

Т-Ли - Т лимфоцити

DAMPs - damage associated molecular patterns

IFN-I - интерферон тип I

Клетъчна смърт

Клетъчната смърт (КС) е сложно и многопластово явление, което е от изключителна важност за туморната система. Настоящият текст цели да хвърли светлина именно върху взаимоотношенията между КС и туморното развитие, които излизат далеч извън дихотомията „живо“/„мъртво“. В туморната система често смъртта е само началото на множество процеси, някои от които благоприятстват, а други потискат развитието на малигнените клетки. В здравия организъм на ден умират средно между 50 и 70 милиарда клетки, като КС, на която са подложени, бива много и различни видове. Според номенклатурата на Комитета, ангажиран с проблемите на КС (Committee on cell death) от 2018 г., като КС се дефинира „Необратима дегенерация на клетъчните жизнени функции, водеща до загуба на клетъчен интегритет (трайна пермеабилизация на клетъчната мембрана или клетъчна фрагментация).“ КС се разделя на:

Инцидентна: „Мигновена и неконтролирана КС, свързана с физическо разрушение на плазмената мембрана, причинено от външни физични, химични или механични фактори.“

Регулирана: „Форма на КС в резултат на активация на една или повече молекули, свързани с вътреклетъчната сигнална трансдукция.“

Програмирана: „Форма на регулираната КС, която се осъществява по стриктно физиологичен сценарий и не се свързва с промени в хомеостазата, както и не се отнася към провал на адаптацията към стресови сигнали.“¹

В туморната система смъртта е навсякъде, тя засяга както туморните клетки, така и раковите стволови клетки, както модифицираните в „супресори“ клетки на имунната система, така и ефекторните клетки на имунната система – Т цитотоксичните (Тс), Т хелперите (Th), „естествените убийци“ (NK),  „естествените убийци Т клетки“ (NKT)².

В туморната система от най-съществено значение се явява регулираната КС (РКС), не на последно място поради реалната възможност върху нея да се повлияе чрез фармакологични и/или генетични интервенции. Към РКС принадлежат множество видове КС с техните характерни особености: апоптоза (външно или вътрешно индуцирана), анойкис, индуцирана КС вследствие на автоагия, автоза, ентоза, фероптоза, лизозом-зависима КС, митохондриално контролирана некроза, митотична катастрофа, митотична смърт, некроптоза, нетоза, партанос, пироптоза¹.

Имуногенна регулирана клетъчна смърт

Най-същественият въпрос по отношение на туморната система е резултатът от РКС, дали КС ще доведе до активация на имунния отговор и неговото антитуморно действие или обратно – ще доведе по потискане на компоненти на имуннния отговор и толеранс към злокачествените клетки. В първия вариант имаме така наречената имуногенна регулирана клетъчна смърт (иРКС), определена като „Форма на РКС, която активира системата на специфичния имунен отговор при имунокомпетентни индивиди.“¹ Имуногенната РКС се характеризира с нарушен интегритет на клетъчната мембрана и отделяне на damage associated molecular patterns (DAMPs), като резултатът е съзряване на дендритните клетки, ефективно антигенно представяне, индукция на имунен отговор и възпаление. Тези процеси ще бъдат разгледани в детайли по-долу. За да се осъществи иРКС в туморната система са необходими три условия: имуногенност, адювантност и способност за проникване в туморната микросреда³.

Имуногенност

Под „имуногенност“ се има предвид способността на туморните клетки да експресират антигени, които могат да бъдат възприети като чужди и да бъдат разпознати от специфичните рецептори на Т лимфоцитите (Т-Ли). До 1960 г. е съществувало схващането, че туморните клетки са „свое“ и не експресират специфични антигени, докато Burnet и Thomas не постулират своята Теория на имунния надзор, където доказват, че туморните клетки експресират специфични антигени, които се разпознават от имунната система като чужди и тя реагира срещу тях. Днес е ясно, че туморната система се характеризира с генетична нестабилност и посттранслационни модификации, водещи до интензивни процеси на експресия на антигени, чужди за организма. Те могат да бъдат de novo формирани неоантигени, „скрити“ антигени, които се ескпресират на повърхността, онкофетални антигени – типични за клетки на по-ранен етап от индивидуалното развитие, както и линейно специфични антигени, типични за други тъкани и клетки в сравнение с произхода на тумора^4-5.

Адювантност

Антигенното разпознаване е недостатъчно за развитие на имуногенен имунен отговор, разпознаването не винаги води до реакция, а дори често води до липса на такава и индукция на имунен толеранс. През 1996 Polly Matzinger лансира т.нар. „Danger hypothesis“. Основен акцент тук пада върху антиген-представящите клетки, в частност дендритните клетки. Идеята на danger хипотезата е, че за развитие на имунен отговор са необходими две условия. Първо, представяне на дадения антигенен епитоп от анти-ген-представящите клетки и второ, антиген-представящите клетки трябва да получат „сигнал опасност“. Акцентът се поставя върху стрес сигналите, активиращи имунната система. Именно сигналите за „опасност“, днес формулирани като „молекулни структури, свързани с клетъчна увреда (damage associated molecular patterns, DAMPs)“ са отговорни за свойството адювантност, безусловно необходимо за иРКС. Тоест, за да се осъществи имунен отговор, са необходии сигнали (DAMPs), които да повлияят на клетките на вродения имунитет, а впоследствие тези клетки да повлияят на Т-Ли. Разпознаване без „сигнал опасност“ води до толеранс, „сигнал опасност“ без разпознаване води до неспецифично възпаление (Табл. 1)^.6,7 .

Табл. 1. Различни сценарии при регулирана клетъчна смърт

Основното действие на DAMPs е върху антигенпредставящите клетки (специално дендритните клетки), които съзряват и от толерогенни се трансформират в имуногенни, като комуникацията им с Т-Ли води до активация на последните. DAMPs се отделят от стресирани и умиращи клетки и са биоактивни молекули като аденозинтрифосфат (АТФ), нуклеинови киселини, протеини и липиди и те се разпознават от т.нар. „pattern recognition receptors“ (PRRs), основно на дендритните клетки. Както стана ясно под влияние на DAMPs, дендритните клетки се трансформират от клетки, които при комуникация с Т-Ли водят в тях до анергия и толеранс в зрели клетки, които, представяйки антигени на Т-Ли, индуцират тяхната активация⁸. Специално в туморната система от голямо значение са DAMPs, които индуцират секреция на интерферон тип I (IFN-I). IFN-I влияят върху дендритните клетки по такъв начин, че те могат да представят секреторни антигени, не само на Т хелперите, а и на Т цитотоксичните клетки – един процес, известен като cross presentation, който е изключително благоприятен в антитуморния имунен отговор, тъй като включва активация на най-мощното оръжие срещу малигнените клетки – Т цитотоксичните лимфоцити – Tc, известни още като CTL (Фиг. 1)⁹.

Фиг. 1. Процес на cross presentation, осъществяван от дендритните клетки под влияние на IFN-I. Класическото антигенно представяне на разтворими извънклетъчни антигени се осъществява заедно с молекула от HLA-II системата, като комплексът се разпознава от Т хелперните лимфоцити. Под влияние на IFN-I дендритните клетки са способни да представят тези антигени и заедно с молекула от HLA-I, което активира Т цитотоксич-ните клетки.

Проникване в туморната микросреда

Ролята на DAMPs се свърза и с привличане на имунокомпетентни клетки в туморната микросреда, като ролята на Pannexin1, АТФ, Annexin A1 и калретикулин (CALR) e особено важна в това отношение. Като цяло можем да обобщим, че DAMPs превръщат имунологично „студения“ тумор в „горещ“ и антигенното разпознаване под влияние на DAMPs води до адювантност и съответно до имунен отговор срещу раковите клетки.² Някои представители на DAMPs, техните PRRs и предизвиканите ефекти са представени на Табл. 2.

Клетъчен стрес и имуногенна регулирана клетъчна смърт (иРКС)

В този патологичен процес иРКС се свързва основно с повлияване на процесите на транскрипция и транслация, както и на нарушаване на микротубулната клетъчна мрежа. Основна причина за тези процеси, водещи до иРКС, е клетъчният стрес и най-вече процес, известен като интегриран стресов отговор. Ключово събитие за този процес е фосфорилирането на фактор, известен като eIF2α от PKR и PERK киназите. Фосфорилирането на eIF2α блокира транслацията на множество протеини. Също така, степента на фосфорилацията корелира с експресията на CALR (Табл. 2) и съответно с ефективни зрели дендритни клетки и инфилтрация от Тс¹⁰.

Табл. 2. Сигнали опасност (DAMPs), рецепторите, които ги разпознават и предизвикания ефект

Важно е да се отбележи, че интегрираният стресов отговор често е свързан със събития, настъпващи в ендоплазмения ретикулум (ЕР), известни като ЕР-стрес, където централно събитие е увеличената експресия на ATF-4. Стресът в ЕР в голяма част от случаите се дължи на т.нар. реакция от неправилно сгънат протеин (unfold protein reaction, UPR). Като сензори за неправилно сгънат протеин служат PERK, ATF-6 и IRE1 и в резултат на активирането си IRE1 осигурява кодирането на XBP1, който е друг рецептор, разпознаван от неправилно нагънатия протеин. Формират се две оси IRE1/XBP1  и PERK/ATF4, които са път за интегриран стресов отговор в резултат, на който се индуцира РКС¹¹. 

Наред с това интегрираният стресов отговор се свързва с индукция на процес, известен като автофагия, при който клетката разгражда ненужните или дисфункцио-нални свои компоненти. Чрез този процес се обновяват структури на повърхността на дендритните клетки и Т-Ли, което води до оптимизиране на процеса на иРКС¹².

Видове иРКС в туморната микросреда

Типовете КС трудно биха могли категорично да бъдат определени в графа „имуногенни“ или „неимуногенни“. Така например апоптозата и автофагията – индуцираната КС, по правило са форми на неимуногенна клетъчна смърт, но при определени обстоятелства могат да имат имуногенни характеристики. В случая с апоптозата имуногенен характер на смъртта могат да предизвикат активацията на NFκB и GAS/STING сигналните пътища¹³.

Въпреки това в туморното обкръжение има три типа клетъчна РКС с подчертано имуногенен характер – некроптоза, пироптоза и фероптоза. Трите вида иРКС имат някои общи морфологични характеристики, но и някои разлики, представени на Табл. 3².

Табл. 3. Характеристика на основните промени на видовете иРКС в туморната микросреда

Некроптоза

Според Комитета, ангажиран с проблемите на КС, като некроптоза се определя „Форма на РКС, стартирана от промени във вътреклетъчната или извънклетъчната хомеостаза, като тази смърт е критично свързана с MLKL, PIPK3 и най-малко по отношение на някои прояви с киназна активност на PIPK1.“¹ Това е имуногенна КС, характеризираща се с липса на каспазна активация, където се наблюдава повишено съзряване на дендритните клетки, тяхната повишена способност за cross presentation и съответно на това повишена ефикасност на Tc в антитуморния отговор. Хомеостатичните „пертубации“ могат да доведат до секреция на TNFα, който се разпознава от своя рецептор, комуникиращ с адапторен протеин, известен като TRAF. Резултатът е активиране на фактори от системата RIP, които от своя страна фосфорилират протеините MLKL. Това води до олигомеризация на MLKL, които образуват пори в клетъчната мебрана и водят до митохондриални увреждания¹⁴. Крайният резултат е отделяне на DAMPs и създаване на йонен трансмембранен канал (Фиг. 2). Некроптозата е ефективна иРКС в антитуморния имунен отговор и като доказателство за това служи установения факт, че намалението на експресията на RIPKs и MLKLs се асоциира с лоша прогноза при солидни тумори. Специално намалената експресия на RIPKs корелира с намалена цитотоксичност на NKT срещу туморни клетки. Важно е обаче да се обърне внимание на факта, че некроптозата може да засегне и ефекторните антитуморни клетки на имунната система. Така например туморните клетки индуцират некроптоза в Т-Ли и в ендотелните клетки и това подпомага процесите на туморно оцеляване и  метастазиране².

Фиг. 2. Схематично елементаризирано изображение на процеса некроптоза

Пироптоза

Според Комитета, ангажиран с проблемите на клетъчната смърт, като пироптоза се определя „форма на РКС, която е критично свързана с формирането на пори в плазмената мембрана вследствие на действие на протеини, известни като газдермини (GSDM), често (но не винаги) като резултат на възпалителна каспазна активация“. Основен момент в процеса на пироптоза е активация и „сглабяне“ на т.нар. „инфламазома“. Инфламазомите представляват сензори на вродената имунна система, индуциращи възпаление вследствие на външен причинител и/или вътрешни протеини. Те са протеинови комплекси, образуващи се в цитоплазмата и са съставени от сензорен протеин, адапторен протеин и прокаспаза-1. Сензорният протеин най-често е от групата на т.нар. NOD-like рецептори и съдържа домен, богат на лизин (lysin rich domain, LRR) и пиринов домен (PYD). Именно с последния сензорният протеин комуникира с пириновия домен на адапторния протеин (ASC), който от своя страна чрез своя CARD домен комуникира с CARD домена на прокаспаза-1. Активирането на инфламазомата води до синтез и секреция на IL-1β и IL-18, които привличат възпалителни клетки. Наред с това се индуцира и пироптоза в клетката – смърт, вследствие на възпалението. Централно събитие за индукцията на пироптоза е активация на газдермини от каспаза-1. Резултатът е разцепване на GSDM на N и C фрагмент, като N флагмените полимеризират и образуват тунел в плазмената мембрана, от който се „изсипват“ DAMPs (Фиг. 3).

Фиг. 3. Схематично елементаризирано изображение на процеса пироптоза

Пироптозата е имуногенна КС с важно значение в индукцията на антитуморен имунен отговор. Установено е, че понижените нива на каспаза-1, IL-18 и IL-1β е явление, типично за туморната тъкан в сравнение със здравата при хепатоцелуларен карцином. Също така има данни, че мишки с каспазен дефицит и дефицит на компоненти на инфламазомата са податливи на химически индуцирани тумори. Дори ако само 15% от раковите клетки са в пироптоза, се наблюдава мощен антитуморен Т лимфоцитен отговор и пълна ремисия при солидните тумори. Т-Ли и NK клетките са способни сами по себе си да индуцират пироптоза в туморните клетки чрез секрецията си на гранзим А и гранзим В. Но разбира се, и при тази форма на клетъчна смърт процесът не е еднозначен. Съществуват данни, че IL-1β и IL-18 индуцират процес на хронично възпаление, който подпомага туморната прогресия, както и че самите инфламазомни комплекси стимулират туморния растеж. Наред с това в туморното обкръжение пироптозата е форма на смърт не само за ракови, но и за ефекторните клетки на имунната система – неутрофили, макрогафи и Т-Ли^2,15.

Фероптоза

Според Комитета, ангажиран с проблемите на КС, като фероптоза се определя „форма на РКС, инициирана от оксидативни нарушения на интрацелуларното пространство, което е под контрола на GPX-4 и тази смърт може да бъде инхибирана от хелатори на желязото и липофилни антиоксиданти“. Централен момент в процеса на фероптоза е желязо-индуцираното натрупване на свободни радикали (ROS), които оксидират полиненаситените мастни киселини в плазмената мембрана. Резултатът е липидна пероксидация и нарушаване структурата на плазмената мембрана. Единственият ензим, който предпазва от индукцията на тези процеси, е GPX-4. В процеса на фероптоза често функцията му е блокирана вследствие на нарушен трансмембранен трафик между глутамат и цистин. В резултат на това вътреклетъчно се задържа цистин, който се метаболизира до цистеин. Цистеинът има свойството ефективно да активира протеин, известен като GSH, който от своя страна блокира GPX-4. В резултат на това навлезлите по пътя на трансфериновия рецептор в клетката тривалентни молекули желязо се редуцират до двувалентни и осъществяват процес на липидна пероксидация. Вследствие на този процес се засяга не само структурата на плазмената мембрана, но се стига и до митохондриална дисфукция (Фиг. 4).

Фиг. 4. Схематично елементаризирано изображение на процеса фероптоза

Фероптозата е ефективен механизъм за индукция на иРКСв туморните клетки. Един важен момент е, че особено чувствителни към нея са т.нар. cancer stem cells (ракови стволови клетки), които се характеризират с наличие на високи нива на желязо. Наред с това Т цитотоксичните клетки използват този механизъм за индукция на КС в туморните клетки. Фероптозата не може да бъде погледната като единствено позитивен аспект на клетъчна смърт на туморни клетки. Известно е, че Т-Ли под влияние на туморното обкръжение могат да намалят експресията си на GPX-4, което води до засилена фероптоза в тях. Също така отново под влияние на туморното обкръжение Тс могат да засилят експресията си на CD36, който е транспортер на мастни киселини и акумулирането на последните прави Т цитотоксичните лимфоцити чувствителни към фероптоза. От друга страна, Тregs – част от имуносупресивния потенциал на туморното обкръжение, имат повишени нива на GPX-4, което ги защитава от фероптоза^2,16.

Супресия на иРКС от туморната микросреда

Имуногенната смърт въпреки многопосочното си действие е все пак по-скоро желано събитие в туморната микросреда (ТМС) за ефективен антитуморен имунен отговор и унищожаване на малигнените клетки. За съжаление, множество тумори разполагат с богат и разнообразен репертоар от средства, чрез които ограничават и променят този процес. Както беше споменато, антигенността, адювантността и способността на имунните клетки да проникват в ТМС са condition sine qua non за индукция на иРКС. В ТМС съществуват механизми, способни да ограничат и трите процеса. По отношение на антигенността при злокачествените тумори се наблюдават процесите, известни като „имуноселекция“ – селективно предимство на туморни клонове с ограничена антигенна експресия и „антигенна модулация“ – непрекъснати промени на експресираните повърхностни антигени, вследствие на интензивни генетични и епигенетични процеси. Наред с това злокачествените тумори често проявяват лимитирана или променена експресия на молекули от HLA-системата, безусловно необходими за антигенното разпознаване от Т клетките.

Още по-разнообразни са средствата, чрез които се потискат адювантността и способността за проникването в тумора. Тук основната „атака“ е срещу DAMPs. Така например калретикулинът (CALR) се повлиява от фактори на туморната система по няколко механизма: той може да бъде задържан вътреклетъчно, неговите свързващи места могат да бъдат лимитирани и злокачествените клетки могат да секретират непълноценна форма на CALR , която да служи за „примамка“ за рецепторите на дендритните клетки. Срещу АТФ, друг ключов DAMP, злокачествените клетки секретират CD39 и CD73, които разграждат АТФ до аденозин-субстанция с имуносупресивен ефект. Обект на въздействие от страна на ТМС са Анексин А1 и HMGB1, като секрецията им от малигнените клетки е силно ограничена, както и F-актин, чиято връзка с рецепторите му върху дендритните клетки е прекъсната от фактори, отделяни от ТМС. Едно от ключовите въздействия на ТМС по отношение на адювантността и способността за проникване на клетките на имунната система е секрецията на екзонуклеази, които модифицират нуклеиновите киселини – едни от най-ефективните DAMPs. Резултатът е дефект в синтезата на IFN-I и последствията са нарушено съзряване на дендритните клетки и понижената им способност за cross presentation³.

Туморната микросреда повлиява и процесите на интегрирания клетъчен стрес, както и директно самата смърт. Така например се секретират представители на BCL фамилията, които потискат процесите на регулирана клетъчна смърт, потиска се експресията на RIPK3 и MLKL, което директно ограничава процеса на некроптоза и се инхибира PERK активацията, което лимитира възможността интегрираният клетъчен стрес да индуцира РКС. Също така установено е, че активираните по време на туморогенезата онкогени водят до формиране на фактори, инхибиращи процеса на автофагия и въпреки че този процес не се свързва директно с имуногенност, е известно, че поне може да я оптимизира³.

Важно е да се отбележи, че описаните действия невинаги се осъществяват директно от туморните клетки, а често са свързани с бенигнените представители, привлечени или модифицирани в ТМС. Такива са Тregs, незрели толерогенни дендритни клетки, М2-макрофаги и миелоидни супресорни клетки¹⁷.

Послания за клиничната практика

Процесите на регулирана клетъчна смърт и тяхното повлияване в посока имуногенност може да се окажат от ключово значение в бъдещи подходи в антираковата терапия. В този аспект се правят множество изследвания, но сложните и нееднозначни процеси трудно могат да бъдат контролирани в желаната насока. Все пак бъдещите знания в детайли за тези процеси биха могли да отворят една нова и обещаваща страница.

Литература

1. Galluzzi L, Vitale I, et.al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the nomenclature committee on cell death 2018. Cell death and differentiation, 2018;25:486-541
2. Liu J, Hong M, Chen D, et al. Programmed cell death tunes tumor immunity. Front. Immunol., 2022;13:1-11
3. Kroemer G, Galassi C, Zitvogel L, et al. Immunogenic stress and death. Nature Immunology, 2022;23: 487-500
4. Schumacher T. and Schreiber R. Neoantigens in cancerimmunotherapy. Science,2015;348: 69–74.
5. Rothlin C, Hille T and Ghosh, S. Determining the efector response tocell death. Nat. Rev. Immunol., 2021;21: 292–304
6. Matzinger P. The danger model: are new edsense of self. Science, 2002; 296:301–305.
7. Banchereau J and Steinman R. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998; 392:245–252.
8. Lutz M and Schuler G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol., 2002; 23:445–449.
9. Galluzzi L, Buqué A, Kepp, et al. Immunogenic cell death in cancer and infectious disease. Nat. Rev. Immunol., 2017;17: 97–111
10. Galluzzi L, Yamazaki T. and  Kroemer G. Linking cellular stress responses to systemic homeostasis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2018;19:731–745
11. Hetz C, Zhang K. and Kaufman R. Mechanisms, regulation and functions of the unfolded protein response. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2020;21:421–438
12. Clarke A. and Simon A. Autophagy in the renewal, differentiation and homeostasis of immune cells. Nat. Rev. Immunol., 2019;19:170–183
13. Hopfner K. and Hornung V. Molecular mechanisms and cellular functions of cGAS–STING signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2020;21:501–521
14. Weinlich R, Oberst A, Beere, H., et al. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2017;18:127–136
15. Broz P., Pelegrin P. and Shao F. The gasdermins, a protein family executing cell death and infammation. Nat. Rev. Immunol., 2020;20:143–157
16. Fuchs Y. and Steller H. Live to die another way: modes of programmed cell death and the signals emanating from dying cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2015;16:329–344
17. Schiavoni G, Gabriela L and Mattei F. The tumor microenvironment: a pitch for multiple players. Front. Oncol., 2013;3:article 90