Смисъл на броя: Оста PD-1L/ PD-1 в процесите на имунна супресия – имунологичен поглед

Основна терапевтична стратегия в съвременната онкология е прилагането на т.нар. „чекпойнт инхибитори“. Терапията се базира на факта, че при редица злокачествени болести туморните клетки експресират молекули, които, комуникирайки със своите партньори на повърхността на Т-клетките, водят до потискане и/или апоптоза на последните. Чекпойнт инхибиторите са моноклонални антитела, блокиращи тези молекули, което цели да „освободи“ Т-клетките от потискащия ефект и да доведе до ефективно антитуморно Т-клетъчно действие. Основните молекулни взаимодействия, ангажирани в този аспект, са PD-L1 с партньор върху Т-клетките PD-1, CTLA-4 с партньор върху Т-клетките B7 (CD80/86)  и LAG-3 с партньор върху Т- клетките HLA-II. Важно е да се отбележи, че тези взаимодействия далеч не са единствените, чрез които раковите клетки могат да супресират Т-лимфоцитите. Нещо повече, инхибицията се осъществява не само чрез контактни взаимодействия, но и чрез цитокини. Допълнително нещата се усложняват, защото много от изброените молекули (напр. PD-1L) могат да функционират и като цитокини в секреторна форма. Във всички случаи оста PD-L1/ PD-1 e обект на особен интерес за биологична терапия в хода на редица злокачествени болести.

Настоящата статия има за цел да покаже „нормалното лице“ на PD-L1/ PD-1 като важно молекулно взаимодействие с ключова роля в регулацията на имунната система. Тоест, тук си поставям за цел да  разгледам PD-L1/ PD-1 не като „противник“, който следва да се унищожи, а като безусловно необходима молекула за нормалните процеси на модулация на имунната хомеостаза. Наред с това, основен индиректен механизъм на туморно „измъкване“ от имунната система е привличането и модулирането на имунни клетки така, че те допълнително да инхибират ефекторните структури на имунния отговор. Този аспект, свързан с ролята на PD-L1/ PD-1,  също ще бъде коментиран в контекста на настоящата статия. Имунната система като всяка система има нужда от „спирачки“ и PD-L1/ PD-1 е именно една от многото такива. Тази система е част от множество имунни взаимодействия, като тук ще бъдат разгледани само две от десетките.

Имунна супресия

Масово възприемана и дори преподавана е догмата, че имунната система дискриминира „свое“ от „чуждо“ и не разпознава собствени структури.  Наред с това, представите за имунната система често почиват на концепцията, че това е система в покой, която се активира при навлизане или образуване на носители на чужда генетична информация. Истината е съвсем различна и отдавна установена – нормално в организма съшествуват множество автореактивни клонове от Т и В лимфоцити, разпознаващи собствени антигени. Също така, имунната система е изключително динамична структура, която поддържа процес на регулация, базиран на непрекъснато разпознаване на собствени структури. Важно място в този сложен и многолик процес заемат механизмите на имунна супресия, целящи преотвратяване на автоимунни реакции.

Механизмите на имуннна супресия се реализират както в централните (тимус и костен мозък), така и в периферните (лимфни възли, слезка, мукозоасоциирана лимфоидна тъкан), органи на имунната ситема, но също така в периферната кръв, паренхимните органи и междуклетъчните пространства. Част от факторите, реализиращи имунна супресия (или по-точно казано имунна регулация), са клетки, които са способни да потискат ключови участници и процеси в имунния отговор. В миналото тези клетки са били определяни като „супресори“. Първоначалната идея за клетки супресори е от началото на 70-те години, когато Gershon описва Т-лимфоцити, които дефинира като „Т-супресори“¹. Идеята е, че това са клетки, които идват от тимуса с вече налични свойства да потискат имунните процеси. В последващите десетилетия се натрупват данни, че нещата са доста по-сложни и нееднозначни. Става ясно, че множество клетки могат да проявяват супресорни свойства – някои постоянно, а други временно. „Супресорите“ могат да бъдат намерени в пула на Т-хелперните клетки (Tregs, Tr1, Th3), но и в пула на Т-цитотоксичните клетки (CD8+CD28-, CD8+HLA-E+), те могат да бъдат намерени сред В лимфоцитите (В10, Вregs, B експресиращ сиалофорин), както и при  клетки, делящи свойства на Т и NK клетки, известни като NKT.

„Супресори“ могат да бъдат клетки, които не са лимфоцити – толерогенните дендритни клетки, мезенхимните стволови клетки, миелодните супресорни клетки и М2 макрофаги. Супресията е навсякъде и някои от клетките, които я проявяват, са „родени“ „натурални“ супресори, дошли с тези си свойства от тимуса (NKT-2, nTregs), но при други супресията е временно функционално свойство и тях можем да наречем „супресори под индукция“ (М2 макрофаги, толерогенни дендритни клетки, мезенхимни стволови клетки, iTregs и т.н.). Всички тези клетки могат да проявяват имуносупресивните си свойства по секреторен път, реализиращ се чрез временна или постоянна секреция на цитокини (IL-10, TGFβ и др.), по метаболитен път, реализиращ се чрез временна или постоянна „доставка“ на вещества (аденозин и др.), повлияващи метаболитните пътища в клетката мишена, или чрез екзозоми – микроскопични мехурчета с активни вещества и молекули, сливащи се с клетъчната мембрана на таргетната клетка и проникващи в нея.

Наред с тези пътища на имунна супресия основен се явява и контактният път, който се осъществява при контактни взаимодействия между различни молекули на повърхността на клетката „супресор“ и нейната мишена. Едни от най-важните такива взаимодействия са между PD-1L и PD1.

PD-1L/ PD-1

Рецепторът, свързан с програмирана клетъчна смърт-1 (Programmed death-1 receptor, PD-1) и неговият лиганд PD-1L представляват система, която е важен механизъм, свързан с регулацията на имунния отговор и като такава пряко свързана с индукция на имунен толеранс и предотвратяване на условия за автоимунитет^2,3. PD-1 се експресира предимно от Т и В лимфоцитите, но може да се екпресира и от NK клетки, моноцити и дендритни клетки. PD-1L се среща върху множество типове клетки, които, освен имунни, могат да бъдат и ендотелни клетки, чернодробни клетки, мезенхимни стволови клетки, астроцити, неврони, панкреатични островни клетки, кератиноцити и др. Важна е експресията му върху туморни клетки, чрез което злокачествените тумори реагират срещу Т-клетките на имунната система⁴. PD-1L има и друга роля в туморната микросреда, като действа като протуморогенен фактор, активирайки способността на туморните клетки да оцеляват и да пролиферират. Наскоро е установено, че един транскрипционен фактор, известен като Sox-2, директно се свързва с промоторния регион на PD-1L и индуцира експресията му, като резултатът е пролиферация на туморни клетки^5,6. Наши резултати също показват едновремената експресия на Sox-2  и PD-1L в култури на стволови клетки, изолирани от глиобластома мултиформе⁷. Под влияние на множество фактори екпресията на PD-1L може да бъде регулирана. Така например тя се увеличава под влияние на проинфламаторни цитокини (IFNγ, TNFα), хипоксия, както и на някои медикаменти⁸. Свързването на PD-1L с PD-1 индуцира серия от сигнали в клетката, експресираща PD-1, които се свързват с индукция на апоптоза, потискане на пролиферацията и промяна на цитокиновата секреция.

Дендритни клетки и PD-1L/ PD-1

Едни от ключовите клетки на имунния отговор, ангажирани в процес на супресия чрез  PD-1L/PD-1, са миелоидните дендритни клетки (ДК). Дендритни клетки са продукт на диференциацията на кръвните моноцити, като процесът преминава през няколо стадия. Първоначалният етап е формирането на незрели дендритни клетки, които се образуват, когато моноцитите са подложени на действието на комбинацията между два цитокина: гранулоцит-моноцит колонио-стимулиращ фактор (GM-CSF) и интерлeвкин 4 (IL-4).  Незрелите дендритни клетки  циркулират в периферната кръв и се характеризират с екстремно силна способност за ендоцитоза на множество собствени и чужди антигени, поради богатия им рецепторен набор, ангажиран в процес. Те имат способността да представят ендоцитираните антигени на Т-клетките, които ги разпознават, но това разпознаване не води до Т-клетъчна активация. Причината е, че незрелите дендритни клетки не експресират множество важни костимулаторни молекули, безусловно необходими да комуникират с партньорите си на Т-клетъчната повърхност. Наред с това незрелите ДК експресират множество молекули, които, комуникирайки с рецепторите си върху Т-клетките, водят до негативен сигнал в тях. Сред тези молекули важно място заема PD-1L.

Резултатът е, че Т-лимфоцитите попадат в състояние, известно като „анергия“ – разпознават антиген, но не се активират срещу него. Именно заради способността си да предизвикат анергия в Т-клетките, незрелите дендритни клетки са известни като „толерогенни“ (тДК)^9,10. Толерогенните дендритни клетки са изключително важно средство за регулиране на имунния отговор и недопускане на имунна атака срещу най-често свързани с апоптоза структури, непредставляващи опасност. Именно „опасността“ обаче ги променя и превръща в зрели дендритни клетки. През 1994 Polly Mazinger  постулира своята danger теория, която акцентира върху опасните сигнали (наречени по-късно молекулни структури, асоциирани с увреда, DAMPs), които се разпознават от незрелите дендритни клетки чрез техните т.н. „pattern recognition“ рецептори¹¹. Резултатът е диференциране в зрели дендритни клетки, които имат други характеристики. Те се характеризират със слаба способност за ендоцитоза, но представят антигени заедно с пълния си набор ко-стимулаторни молекули, което води до активация на Т-клетките и имунен отговор срещу представения антиген¹⁰. В идеалният вариант туморното обкръжение би следвало да представлява една амалгама от сигнали за опасност, но за съжаление, реалната ситуация е напълно различна. Под влияние на туморната микросреда ДК получават сигнали, които ги задържат във фаза незрели и съответно индуциращи толеранс срещу туморните антигени¹². Такива сигнали са представени в Табл. 1. и тяхното въздействие води до експресия и секреция на множество фактори, потискащи имунния отговор от страна на тДК. Както се вижда от таблицата, в случая с експресията на PD-1L основна роля играят секретираните от туморното обкръжение TGFβ и простагландин E2 (PGE2).

Табл. 1. Фактори, отделяни от туморната система, водещи до формиране на  незрели толерогенни дендритни клетки със съответните експресирани и секретирани имунносупресивни фактори

Накратко, туморното обкръжение, вместо да индуцира имуногенни дендритни клетки, ги задържа във фаза толерогенни с висока експресия на имуносупресивни молекули (PD-1L, HVEM, ILT-4) и секреция на имуносупресивни цитокини (IL-10, TGFβ, PGЕ2).

Въздействието на туморната микросреда върху дендритните клетки е само една малка част от процеса, известен като „stromal corruption“ – способността на туморната система да модифицира клетките на имунната система.

Имунната супресия, осъществявана от тДК чрез PD-1L се извършва по два начина – директен и индиректен. При директния механизъм PD-1L на повърхността на тДК се свързва с екстрацелуларния N-терминален домен на PD-1 на повърхността на Т лимфоцита. PD-1 притежава още хидрофобен трансмембранен домен и вътреклетъчна цитоплазмена опашка с два тирозинови остатъка: immune receptor tyrosin based inhibitory motif (ITIM) и immune receptor tyrosin based switch motif (ITSM). Инхибиторният ефект, осъществяван от PD-1 под влияние на връзката му с PD-1L, се реализира предимно чрез ITSM, който се фосфорилира и привлича SHP-1 и SHP -2. Те, от своя страна, дефосфорилират активационните молекули, които Т-клетката активира чрез сигнал през своя Т-клетъчен рецептор (ТКР) – ZAP-70 и CD3δ. Резултатът е блокиране на пътя, осъществяван от PI3K/Akt, което от своя страна повлиява апоптотичните пътища и води до Т-клетъчна апоптоза (Фиг. 1). Допълнително PD-1L/PD-1 се свързва с потискане на Ras/MEK/ERK системата, което води до намалена пролиферативна способност на Т-лимфоцитите, както и промени в цитокиновата им секреция.^2,3 Индиректният механизъм на действие, което тДК осъществяват върху Т- лимфоцитите чрез PD-L1/ PD-1, е свързан със „създаването“ на субпопулация от Т- хелперни лимфоцити, известни като Тregs.

Фиг. 1. Директно блокиращо и апоптотично действие върху Т-клетките вследствие на PD-1L/ PD-1. Връзката води до фосфорилиране на ITSM, привличане на SHP-1 и SHP-2, които се дефосфорилират и потискат асоциираните с ТКР активационни сигнали  ZAP-70 и CD3δ. В резултат се инхибира PI3K/ AKT пътя, което води до проапоптозен и антипролиферативен ефект в Т-лимфоцитите

Tregs и PD-1L/ PD-1

Тregs са най-близо до идеята за „Т-супресори“, формулирана през 70-те години на 20-ти век. Важно е да се уточни, че те се формират по два начина: в единият вариант Тregs се образуват директно в тимуса и това са естествените, натурални Тregs (nTregs)¹³. В другия вариант обаче те се формират от пула на конвенционалните Т хелпери в резултат на въздействие, като основна форма на това въздействие е комуникацията между PD-1L на повърхността на дендритните клетки с PD-1 на повърхността на T-хелперите. Тази комуникация води до взаимодействие между SHP-1 и SHP-2 с протеини от системата STAT. Резултатът е конверсия на конвенционалните Т-хелпери в Tregs.

Основна роля за този процес има стимулирането на въртреклетъчната експресия на FoxP3 – основният фактор, характеризиращ Treg популацията и сам индиректно ангажиран в имунната супресия, осъществявана от нея¹⁴. Тregs са клетки, които са в състояние на анегрия и имат слаб пролиферативен капацитет, но някои сигнали от тъкани могат да ги „събудят“ и те да започнат да осъществяват имуносупресивната си функция. Такива сигнали са стимулация на техния рецептор от „свои“ или „чужди“ антигени, стимулация на CD-28, както и влиянието на някои цитокини като IL-2, IL-4 и IL-15. Наред с тези сигнали, от ключово значение не само за създаването, но и за „събуждането“ на Тregs e връзката на PD-1L с експресираната на повърхността им PD-1. Активирането на Tregs води до осъществяване на широка гама имуносупресивни ефекти, реализирани чрез цитокини (TGFβ и IL-10), метаболити (аденозин) и контактни молекули, разпознаващи своите партньори на повърхността на таргетните клетки (CTLA-4, LAG-3, PD-1L).^15,16

Прави впечатление, че Tregs експресират както PD-1, така и PD-1L,  като от тази гледна точка те се явяват както обект (PD-1L на повърхността на дендритните клетки разпознава PD-1  на повърхността на Tregs), така и субект (PD-1L на повърхността на Тregs  разпознава PD-1 на повърхността на своите мишени) на тези взаимоотношения. Чрез PD-1L Тregs осъществяват своята имуносупресивна функция предимно върху Т- лимфоцитите по директния механизъм, описан по-горе¹⁷ (Фиг. 2 А). Наред с това обаче, Тregs могат да действат и индиректно, използвайки други “checkpoints“. Под влияние на Tregs дендритните клетки са задържани в незряло състояние и следователно, както по-горе беше обсъдено, придобиват имуносупресивен фенотип. Това се осъществява при взаимодействия между LAG-3 и CTLA-4, експресирани върху повърхността на Tregs с техните партньори, респективно HLA-II и B7 на повърхността на дендритната клетка (Фиг. 2 Б).

Фиг. 2. Действие на Trеgs. Директна супресия върху Т-лимфоцитите (А) и „създаване“ на незрели толерогенни дендритни клетки (Б)   

LAG-3/HLA-II връзката води до поредица от събития, свързани с неспособност за съзряване на дендритната клетка. CTLA-4  от своя страна се свързва със своя лиганд, известен като B7 комплекс, и това води до неговото ”прибиране“ от повърхността вътре в клетката – процес, известен като трансендоцитоза¹⁸. B7 e ключова костимулаторна молекула на повърхността на дендритните клетки, която комуникира със CD-28 на повърхността на Т-клетките. Липсата ѝ води до липса на т.нар. „втори сигнал“ за Т-клетъчна активация, като резултатът е анергия на Т-лимфоцитите при комуникацията им със „създадените“ от Tregs толерогенни дендритни клетки.

Следователно оста PD-1L/PD-1 е агажирана както в потискане и апоптоза на Т- лимфоцитите, така и в създаване на нови супресори. Както се вижда от Фиг. 3, толерогеннните дендритни клетки и Тregs взаимно подддържат своя имуносупресивен фенотип и функции, като едно важно, но далеч не единствено „оръжие“ в този процес е системата PD-1L/PD-1^19,20. Това взаимно индициране на клетки с имуносупресивен потенциал е известно като „инфекциозен толеранс“, една концепция още от 70-те, интензивно преоткривана от модерната имунология¹.

Фиг. 3. Толерогените дендритни клетки и Tregs,  използвайки оста PD-1L/PD-1, потискат Т-лимфоцитите и индуцират в тях процес на апоптоза. Наред с това, тДК „създават“ Tregs, като част от „инструментите“ за това е именно системата PD-1L/PD-1,  а Тregs „създават“ тДК чрез взаимодействията LAG-3/ HLA-II и CTLA-4/B7

Послания за клиничната практика

Оста PD-1L/PD-1 не бива да се възприема като нещо лошо, което е наш „враг“, и трябва да се гледа еднопосочно единствено като фактор за блокиране. Тази система е ключово необходима за имунната хомеостаза и освен при злокачествените клетки, тя е повсевместно разпространена и безусловно жизнено необходима. Използването на чекпойнт инхибитори безспорно е революция в онкологията, но винаги следва да се има предвид и тяхната „тъмна страна“. Блокирането на ключови инхибиторни сигнали води до реалния риск от автореактивност и развитие на автоимуннно заболяване и след първоначалното опиянение от чудесните резултати, този въпрос започва да придобива актуалност. Търсенето на баланса при прилагане на чекпойнт инхибиторите е истинско предизвикателство в съвременната онкология и имунология.

Литература

1. Gershon R. and Kondo K. Infectious immunological tolerance. Immunology, 1971; 21:903 – 914.
2. Bardhan K., Anagnostou T and Boussiotis VA. The PD1: PD-L1/2 Pathway from Discovery to Clinical Implementation. Front. Immunol., 2016;7 (550):1 – 17.
3. Gianchecchi E., Delfino DV, Fierabracci A. Recent insights into the role of the PD-1/PD-L1 pathway in immunological tolerance and autoimmunity. Autoimmun. Rev., 2013;12:1091 – 1100.
4. Okazaki T, Chikuma S, Iwai Y, et el. A rheostat for immune responses: the unique properties of PD-1 and their advantages for clinical application. Nat Immunol., 2013 14:1212 – 1218
5. Dong P, Xiong Y, Yue J, et al. Tumor-Intrinsic PD-L1 Signaling in Cancer Initiation, Development and Treatment: Beyond Immune Evasion. Front. Oncol., 2018; 8:386.
6. He J., Hu Y., Hu M., et.al. Development of PD-1/PD-L1 pathway in tumor immune microenvironment and treatment for non-small cell lung cancer. Sci Rep., 2015; 5:13110
7. Tumangelova-Yuzeir K., Minkin K., Angelov I., et al. Alteration of Mesenchymal Stem Cells Isolated from Glioblastoma Multiforme under the Influence of Photodynamic Treatment. Current Issues in Molecular Biology., 2023; 45(3):2580 – 2596
8. Dutta Sh., Ganguly A.., Chatterjee K., Spada Sh., et al. Targets of immune escape mechanisms in cancer: Basis for development and evolution of cancer immune checkpoint inhibitors. Biology, 2023;12:218 – 261
9. Banchereau J. and Steinman R. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998; 392:245 – 252.
10. Lutz M. and Schuler G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol., 2002; 23:445 – 449.
11. Matzinger P. The danger model: are newed sense of self. Science, 2002; 296:301 – 305.
12. Ma Y, Shurin G, Gutkin D, et al. Al. Tumor associated regulatory dendritic cells. Semin.Cancer Biol., 2012; 22,298 – 306.
13. Baecher- Allan C., Viglietta V., Hafler A. Human CD4+CD25+ regulatory T cells. Seminars in Immunology., 2004; 16:89 – 97
14. Cai J, Wang D, Zhang G, et al. The role of PD-1/PD-1L axis in Treg development and function: implications for cancer immunotherapy. Onco Tergets and therapy, 2019; 12:8437 – 8445
15. Fontenot J, Gavin M, Rudensky A. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol., 2003; 4:330 – 336
16. Gavin M, Clarke S, Negrou E, et al. Homeostasis and anergy of CD4(+)CD25(+) suppressor T cells in vivo. Nat Immunol., 2002; 3:33 – 41.
17. Shmitt E and Williams C. Generation and function of induced regulatory T cells. Front. Immunol., 2013; 4: article 152
18. Quereshi O, Zheng Y, Nakamura K, et al. Trans-endocytosis of CD80 and CD86: a molecular basis for the cell- extrinsic function of CTLA-4. Science, 2011; 332:600 –  603
19. Mahnke  K, Johnson T, Ring S, et al. Tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells: a two-way relationship. J. Dermatol. Sci., 2007; 46:159 – 167.
20. Hubert P, Jacobs N, Caberg J, et al. The cross-talk between dendritic and regulatory T cells: good or evil? J Leukoc Biol., 2007; 82:781–794.