Проведената в София от 8 до 10 октомври 2009 г. IX Международна конференция за напредъка във ваксинотерапията на рака (PIVAC 9*) се състоя благодарение на обединените усилия на Българската асоциация по имунология (BАCI), представена от проф. Елисавета Наумова от Катедрата по имунология към МФ София, Bulgarian Cancer Society, представено от Асен Дудов (България) и Европейското дружество по имунология и имунотерапия на рака (ESCII), представена от Graham Pavelec (Germany), Robert Rees (UK), Mike Papamichail (Greece), Olivera Finn (USA), Pierre Coulie (Belgium), Rolf Kiessling (Sweden). От изнесените общо на седемте сесии около 23 лекции и съобщения само 8 бяха за приложение на ваксини при лечения на пациенти с неоплазми, докато останалите бяха изследвания на експериментални животни (мишки). Поради обширността на материята по-долу ще дадем в резюме само някои от тези клинични проучвания.
Програмата на Международната конференция PIVAC 9 започна с представянето на основната лекция (Keynote presentation) извън сесиите на конференцията, изнесена от G. Gaudernak (Норвегия) за теломеразната ваксина GV1001, приложена на болни от недребноклетъчен белодробен рак и малигнен меланом. За съжаление, текстът на тази лекция не беше отпечатан заедно с останалите доклади, изнесени на пленарната сесия в издадения сборник. G. Gaudernak обаче, заедно със своите сътрудници, беше представен и на постерната сесия с два постера: първият е озаглавен „Т-клетъчен отговор на пациенти, ваксинирани с Telomerase (hTERT)-mRNA трансфектирани дендритни клетки”, а вторият – „Clinical-scale manufacturing of transiently redirectеd T cells for adoptive transfer”, резюмета от които са отпечатани в сборника. Поради важността на лекцията ще представим по-долу нейното кратко резюме и основните данни от споменатите два постера на Gaudernak и сътрудници.1
Изложението на Gaudernak (Section for Immunotherapy, Oslo University Hospital) за теломеразната ваксина GV1001 започна с въпроса: „Можем ли да повлияем протичането на раковото развитие у болни с недребноклетъчен белодробен рак?” За да отговори на този въпрос, Gaudernak в началото на лекцията си, както и в резюметата на двата постера, интерпретира възможностите на спонтанната имунна реакция на Т-клетките срещу раковите клетки, подпомогнати с допълнително усилване на ефекта им с методите на ваксинотерапията. Накратко, авторът проследява имунната реакция на Т-клетките преди започване на имунотерапията със споменатата ваксина GV1001, както и повлияването на раковите образувания при адоптивен трансфер на тумор-специфични Т-клетки. Резултатите, получени от Gaudernak и сътр., са показали, че Т-клетките предизвикват регресия на установените тумори у изследваните пациенти. Независимо от този благоприятен ефект, получаването на достатъчно количество функционални Т-клетки, необходими за потискане на туморния растеж, се е оказало труден процес, което е насочило авторите към изследване възможностите на ваксинотерапията, подпомагаща собствените Т-клетки на раковоболните в борбата им с рака.
В началото на клиничното изпитване пациент в ІV стадий на белодробен недребноклетъчен карцином и пациент с неоперабилен аденокарцином на панкреаса са ваксинирани с автоложни, диференцирани от моноцитите дендритни клетки (ДК), трансфектирани с mRNA, кодираща eнзима Telomerase (hTERT) – т.е. споменатата по горе теломеразна ваксина GV1001. Това предварително проучване е направено, за да се изследва безопасността, поносимостта и имунният отговор към ваксината преди започването на новата фаза І/ІІ на клиничното изпитване. Пациентите първоначално са получавали ваксината в продължение на четири седмици, последвани от реваксиниране с 2 х 106 ДК, инжектирани вътрекожно. Преди първите четири ваксинации, както и след петата, и след дванадесетата седмица на лечението, са изолирани от периферната кръв мононуклеарни клетки, които са стимулирани in vitro с трансфектирани ДК. Предварителното изследване е направено и със специфични към hTERT CD8+ Т-клетки, мониторирани с пентамерно оцветяване. Авторите установяват, че описаното лечение е добре понасяно от пациентите и е имало само минимални странични ефекти. Лечението е довело до удължаване живота на пациентите, като състоянието на пациента с аденокарцинома на панкреаса е останало стабилно в продължение на 44 месеца след диагностицирането на рака. Пациентът е показал след ваксинацията специфична Т-клетъчна пролиферация в отговор на mRNA-натоварените ДК in vitro. Освен това, авторите са установили стабилна популация на теломеразно (hTERT)-специфичните CD8+ Т-клетки у двамата лекувани пациенти с метода за пентамерното им оцветяване в следваксинационните проби. Пробите от двамата пациенти са тестувани и с панел от 24 припокриващи се (overlapping) теломеразни (hTERT) пептиди и са открити множество Т-клетъчни отговори и срещу много от тези пептиди. Т-клетъчните отговори към тези епитопи са идентифицирани както при неваксинирани раковоболни, така и при раковоболни, ваксинирани преди това с GV1001 теломеразен пептид, което е изтълкувано като висока степен на имуногенност и HLA-промискуитет. Този клиничен опит е показал, че ваксинацията с hTERT-mRNA трансфектирани ДК е безопасна и способна да предизвика силен имунен отговор към няколко теломеразни Т-клетъчни епитопи и в двете популации Т-клетки – CD4+ и CD8+. За по-голяма ефективност на лечението Gaudernak препоръчва ваксинирането с теломеразната ваксина GV1001 да се комбинира при възможност с temozolоmide.2
Резултатите на Gaudernak и сътр. показват възможностите за широкото клинично приложение на този имунотерапевтичен подход при лечението и на други неоплазии, пример за което е техният клиничен опит за приложението на теломеразните (hTERT) пептиди за лечението на меланомите. Отговарящите на ваксината Т-клетки могат да реагират с неконвенционални фенотипове клетки, а отделяните цитокини да не отговарят на класическите Тh1 и Th2 имунни отговори. Авторите са получили успех в 78% от лекуваните болни с меланом, особено при комбиниране на това лечение с cyclophosphamide или temozolomide.
Тук е мястото да се направи кратък коментар за теломеразната (hTERT) ваксина на Gaudernak и коментара да се свърже със следващата лекция на Graham Pavelec и сътр. за имунното остаряване (Immunesenescence) и рака. По принцип ензимът теломераза спада към класа на т.нар. реверсни транскриптази и е в основата на добилата голяма популярност на Запад антивъзрастова терапия. Намаляващата активност на теломеразата с възрастта се свързва с биологичните механизми на стареенето. Оттук и приемането на теломеразата за ензим, удължаващ живота на хромозомите и живота на индивида въобще, както и за ензим, участващ в антитуморната резистентност. Теломеразната активност обаче намалява с напредването на възрастта, което логично води до зачестяване и на злокачествените новообразувания. Тази зависимост всъщност беше в основата на големия брой съобщения и постери, представени на конференцията, в които на опитни животни (мишки) се потвърждава правилото за зачестяването на неоплазмите с възрастта на опитните животни.
Sjoerd H. van der Burg и сътр. (Departments of Clinical Oncology, Холандия) докладваха в сесията Tumour escape за рoised (поддържани в равновесие) на НРV16-специфичните Т-клетки при цервикален карцином и неговите метастази в дрениращите лимфни възли.3 В началото лекторът отбеляза, че той и сътрудниците му са проучвали локалният Т-клетъчен репертоар на пациентки с цервикален карцином, свързан с човешките папилома-вируси (НРV). Те са направили системен анализ на съотношението, формирането и поляризацията на НРV Е6/Е7-специфичните Т-клетки вътре в цялата популация на инфилтриращите тумора лимфоцити (TIL) и клетките в тумор-дрениращите лимфни възли (TDLNC). Изолираните клетки са стимулирани с набор от припокриващи се (overlapping) Е6 и Е7 пептиди и анализирани с мултипараметрична флоуцитометрия по отношение на тяхното активиране, продукция на цитокини и наличие на Т-клетъчния рецептор Vb (TCRVb). Отговорът на специфичните към НРV CD4+ и CD8+ Т-клетки е откриван както при TIL, така и при TDLNC в 11 пациентки и относително число на тези клетки е варирало между 1% до 66% от всички Т-клетки. Общо казано, НРV-специфичните отговори са намерени изненадващо високи както по отношение на многото Е6 и Е7 епитопи, така и за многото доминанти и субдоминанти на Т-клетъчния рецептор Vb (TCRVb) за единичните епитопи. При повечето от пациентките са намерени само единични IFNg продуциращи Т-клетки, което е прието за белег, показващ, че те са токсично увредени, функционално неактивни Т-клетки. Заключението на авторите, направено от тази находка, е, че стимулирането на TIL и TDLNC с когнатен (сроден) антиген в присъствие на общо употребяваните toll-подобни рецептор-лиганди значително повишават ефекторната Т-клетъчна функция. Това би подпомогнало активирането на намираните при пациентките с цервикален рак, причинен от НРV, на локално представени много различни тумор-специфични CD4+ и CD8+ Т-клетки, които могат да бъдат експлоатирани за имунотерапията на рака.
E. Gabrilovich и сътр. (Cancer Center and Rresearch Institute, Tampa, FL, 33647, САЩ) са авторите на изнесената лекция на тема: „Механизъм на синергичния ефект на имунотерапията и химиотерапията на рака”. Независимо от напредъка, постигнат напоследък с новите химиотерапевтични лекарства, и на радиационната терапия, често пъти те не са в състояние да контролират туморната прогресия. За илюстрация на това си заключение лекторът демонстрира на екрана една котка, която се оглежда в огледалото и се вижда в образа на лъв. Явно, това беше намек за надценяваните възможности на химио- и радиотерапията и същевременно беше анонс за ролята на имунотерапията на рака, с което би се постигнал синергичен ефект при лечение. Този синергизъм авторът вижда в терапевтичните ваксини за лечение на рака и адоптивният Т-клетъчен трансфер, които от известно време се разглеждат като твърде атрактивна терапия за лечението на рака. Все пак, независимо от идентифицирането на много от тумор-асоциираните антигени, разпознавани от цитотоксичните Т-лимфоцити (СТL), клиничните проучвания на различни ваксини за лечението на рака, създадени през последните години, според Gabrilovich показват често пъти липса на клинична ефективност. Оказало се е, че имунотерапията на рака среща много предизвикателства. Те включват възможността ваксинирането да генерира потентен имунен отговор, представен от присъствието на много имуносупресивни фактори, възможността на цитотоксичните Т-клетки да проникват в паренхима на тумора и да разпознават тумор-асоциираните антигени, което позволява коректен избор на антигени за имунизация и т.н. Вече се изясни, че терапевтичните ракови ваксини, приложени самостоятелно, могат и да не предизвикат клинично подобрение и това да наложи комбинирането му с конвенционалните методи на лечение. Все пак приложението на конвенционалната химиотерапия на рака в комбинация с раковите ваксини не се оценява като много подходяща главно заради потентният им имуносупресивен ефект, свързан с химиотерапията.
Daniel Speiser (Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne, Швейцария) изнесе лекция на тема: „Индукция на многофункционални високоактивни човешки тумор-специфични CD8+ Т-клетки, които могат да преодолеят предизвиканата от тумора имунна супресия”. Авторът отбелязва, че съществуват големи различия във възможностите на различните ваксини да активират тумор-специфичните Т-клетки и тяхната функционална активност да остане недостатъчно проявена. След ваксинирането на пациенти, страдащи от меланом, със смес от туморния пептиден антиген Melan-A/MART-126-35 CpG ODNs и непълен адювант на Freund (IFA) специфичните Т-клетки се увеличават бързо и достигат висока честота (средно ≥ 1% от циркулиращите CD8+ Т-клетки). Направеният пряк ex vivo анализ разкрива значителна антиген-специфична цитолитична функция и цитокинна продукция от Т-клетките. Данните на автора са показали, че убиването на туморните клетки отчасти се спъва от ниската авидност и активност на Т-клетъчния рецептор (TCR), както и от дефицита на експресирани перфорини/гранзими с цитолитична функция. Генерацията на имунокомпетентни CD8+ Т-клетки зависи от успешната стратегия за активиране на високо авидните Т-клетъчни рецептори, както и на засилен Тh1 (клетъчен) тип имунен отговор, включващ и продукцията на IL-12.
Основна тема за лекцията на P. Straten (Center for Cancer Immune Therapy, 54P4 University Hospital, Herlev Ringvej, Дания) беше CD8+ Т-клетъчният отговор срещу пептидите от indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO, индуциран от IFNg ензим) и heme oxygenase-1 (HO-1, клетъчнопротективен ензим, катализиращ и деградацията на хема), изследвани при раково болни. Авторът приема, че главните стратегичecки трудности, свързани с имунологичното таргетиране на раковите клетки, зависи от не добре подбраните подходящи антигени. Изследванията на автора в тази насока са му позволили да проучи и характеризира пептидни антигени, рестриктирани от HLA клас І молекули, които му позволяват таргетирането на раковите образувания, откриване на техните метастази, контрол на апоптозата, регулацията на клетъчния цикъл, както и резистентността им към лекарствата. Напоследък авторът и неговите сътрудници са въвели програма, с която постигат таргетирането на протеини, свързани с имунното потискане, експресирани от раковите клетки или от клетки в микросредата. Ензимът indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) проявява установена имунопотискаща функция при рака. Експресира се в самия тумор, както и в антиген-представящите клетки в дрениращите тумора лимфни възли, където предизвиква периферен имунен толеранс към туморните антигени. В настоящето проучване авторите тестират идеята дали IDO сам по себе си не е субект на имунния отговор. Те установяват, че реактивните към IDO Т-клетки в крайна сметка са пептидо-специфични цитотоксични ефекторни клетки. По този начин IDO-реактивните Т-клетки са в състояние да разпознаят и убият туморните клетки, както това постигат и IDO-експресиращите дендритни клетки – една от главните имуносупресиращи клетъчни популации. Тава означава, че IDO може да служи като важна и широкоприложима мишена за антиракова имунотерапевтична стратегия.
Нeme oxygenase-1 (HO-1) е дефинирана като цитопротективен ензим с антивъзпалителна функция, експресиран с високо ниво в малигнените клетки. HLA-А2 рестрииктираните CD8+ Т-клетки, специфични за антивъзпалителните молекули HO-1, които са били открити ex vivo и in sito сред Т-клетките от раково болни, са били в състояние да потискат ефикасно клетъчният (Тh1) имунен отговор. Освен това, HO-1-специфичните Т-клетки потискат освобождаването на цитокини, както и пролиферацията, и цитотоксичността на другите имунни клетки. Авторът подчертава, че инхибиторният ефект на HO-1-специфичните Т-клетки е далеч по-дефиниран от този на конвенционалните CD4+ CD25+ CD127- Tregs.4
Kris Thelemans и сътр. (Vrije Universiteit, Brussel, Белгия) докладваха за новата генерация DC (дендритноклетъчни) ваксини, т.нар. TriMix modified dendritic cells, като нова по дизайн клетъчна ваксина. Според авторите тази ваксина е с голям капацитет да индуцира антитуморен имунен отговор. Дендритните клетки получават активационния сигнал чрез електропорация (електропермеабилизация) с mRNA, кодираща т.нар. TriMix, представляващ CD40 лиганд (CD40L), CD70 и конститутивна активна форма на toll-подобен рецептор 4 (саTLR4).5 Комбинацията на CD40L и саTLR4 електропорация наподобява CD40 лигацията и TLR4 сигнализацията на дендритните клетки и генерират фенотипното им узряване и цитокинно/химиокинната секреция от тези клетки. Въвеждането на CD70 в дендритните клетки представлява силен костимулаторен сигнал за CD27+ наивните Т-клетки, който потиска активирането на апоптозата на вече активираните Т-клетки и поддържа Т-клетъчната пролиферация. Авторите засега са прилагали тази ваксина за предклинични проучвания, като пилотна фаза 1 за лечение на пациенти с меланом. На 24 болни лечението на меланома е започнато с IFN alfa-2b и на двама с моноклоналното антитяло ipilimumab, последвани от ваксината на авторите. Продължилото наблюдение е показало регресия на метастазите при 5 болни от общо 17.
В лекцията си D. Gomez от името на голям брой свои сътрудници (Лаборатория по молекулярна онкология към Quilomes National University, Buenos Aires, Аржентина) докладва за клинико-експерименталните им проучвания на моноклоналната антиидиотипна туморна ваксина срещу N-Glicolyl-съдържащи ганглиозиди наречена racotumomab (1E10). Както личи от името на ваксината racotumomab, последната частица mab показва, че става дума за моноклонално антитяло (МКА), получено при имунизирането на BALB/c мишки с Abl-моноклонално антитяло, способно да реагира специфично с N-Glicolyl-съдържащи ганглиозиди. В случая ганглиозидната молекула става атрактивна мишена за имунотерапията на рака. Самите N-Glicolyl gangliosides са кисели гликолипиди, които не се експресират нормално в човешките тъкани, но са свръхекспресирани в солидните тумори като напр. при белодробен карцином. Racotumomab е в състояние да реагират специфично с N-Glicolyl-съдържащи ганглиозиди. Изследването е направено на 19 болни с висок риск (ІІ и ІІІ стадий на болестта) или с метастазирал белодробен карцином, като пациентите са ваксинирани с различни дози racotumomab (0.5, 1, и 2 mg). Racotumomab е бил в състояние да развие строго специфичен серумен антителен отговор срещу NgGM3 ganglioside и към собствения тумор. Допълнително е установено включването на Т-клетки в антиидиотипния отговор и индуцираната секреция на IFNg.
_____________________
* Ninth International Conference on Progress in Vaccination Against Cancer. PIVAC 9, October 8 -10, 2009, Hilton Hotel, Sofia, Bulgaria.
1 Адрес на авторите: Section of Immunotherapy and Department of Cellular Therapy, Institute for Cancer Research, Radiumhospitalet, University Hospital, Oslo, Norway. В сътрудничество с UCL Cancer Institute. University College London,UK.
2 Temozolоmide (temodal) – орален алкилиращ препарат за лечение на ІV ст. карциноми. Като алкилиращ цитотоксичен агент се превръща при физиологично pH в късо живящо съединение monoethyl-triazeno imidazole carboxamide. Освен за лечение на рак, се прилага и за лечение на мозъчни тумори, глиобластома мултиформе и астроцитома.
3 Oригиналното заглавие: An unexpectedly large polyclonal repertoire of НРV-specific Т cells are poised for action in patients with cervical cancer.
4 Tregs означава най-често Т-регулаторни клетки (T- regs), към които принадлежат Т-клетъчните субпопулации CD4+ CD25+ CD35+ CD101+. Превръщането им в регулаторни Т-клетки става от дендритните клетки. Tregs подтискат някои неадекватни отговори на имунната система, като по този начин предотвратяват автоимунните реакции. Тези данни са публикувана в J Clin Invest 2009; 119(8).
5 саTLR4 – клас от протеини, които играят ключова роля във вродения (innate) имунен отговор. За toll-like-рецептори и имуностимулация – доклад пред симпозиум „Акад. Чудомир Начев” от доц М. Николова и д-р Д. Стканкулова на 5 декември 2009 г. Информация в Google за TLR, експресирани вдърху макрофаги, моноцити, дендритни клетки и др. Toll-like-рецепторите активират апоптозата и усилват придобития имунен отговор.