Мултирезистентната туберкулоза в България – генни мутации, асоциирани с нея

Резюме

Целта ни бе да проучим най-често срещаните мутации, асоциирани с мултирезистентната туберкулоза (MDR-TB) в България, като по този начин подпомогнем определянето на индивидуалните терапевтични режими на MDR-TB пациентите  в страната. В Националната референтна лаборатория по туберкулоза на Националния център по заразни и паразитни болести  (НРЛ ТБ, НЦЗПБ) с молекулярно генетични тестове бяха проучени 222 MDR-TB щама, изолирани от цялата страна, за осемгодишен период – от 2007 до 2014г.

Най-често срещаната мутация в rpoB гена, определяща резистентност към Рифампицин, бе S531L в 86,49%. Характерна особеност на проучените български щамове за резистентност към Изониазид бе, че преобладаваше мутацията С15Т (48,65%) в inhA гена, следвана от S315T1 (26,13%) в katG гена. Най-честата мутация в gyrA гена при резистентните към флуорохинолони беше А90V (11,76%), а за резистентните към аминогликозиди и циклични пептиди мутацията –  А1401G в  rrs гена беше открита в 100% от случаите.

Ключови думи: MDR-TB, LPA, мутация

Abstract

The aim of our study was to identify and describe the most common mutations, associated with multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) in Bulgaria and this way to help defining the individual therapeutic regiments for MDR-TB patient in the country. In TB National Reference Laboratory, National Center of Infectious and Parasitic Diseases (TB NRL, NCIPD) a total number of 222 MDR-TB strains from all over the country were tested, for eight-year period 2007 to 2014.

The most common mutation in rpoB gene, associated with resistance to Rifampicin, was S531L (86.49%). A characteristic feature of examined Bulgarian MDR-TB strains was the prevalence of С15Т (48.65%) in inhA gene, followed by S315T1 (26.13%) in katG gene. The most common gyrA mutation in MDR-TB strains with Fluoroquinolone resistance was A90V – 11.76% and 100% of the Aminoglycosides/Cyclic peptides resistant strains harbor the A1401G mutation in rrs gene.

Кey words: MDR-TB, LPA, mutation

Резюме

Целта ни бе да проучим най-често срещаните мутации, асоциирани с мултирезистентната туберкулоза (MDR-TB) в България, като по този начин подпомогнем определянето на индивидуалните терапевтични режими на MDR-TB пациентите  в страната. В Националната референтна лаборатория по туберкулоза на Националния център по заразни и паразитни болести  (НРЛ ТБ, НЦЗПБ) с молекулярно генетични тестове бяха проучени 222 MDR-TB щама, изолирани от цялата страна, за осемгодишен период – от 2007 до 2014г.

Най-често срещаната мутация в rpoB гена, определяща резистентност към Рифампицин, бе S531L в 86,49%. Характерна особеност на проучените български щамове за резистентност към Изониазид бе, че преобладаваше мутацията С15Т (48,65%) в inhA гена, следвана от S315T1 (26,13%) в katG гена. Най-честата мутация в gyrA гена при резистентните към флуорохинолони беше А90V (11,76%), а за резистентните към аминогликозиди и циклични пептиди мутацията –  А1401G в  rrs гена беше открита в 100% от случаите.

Ключови думи: MDR-TB, LPA, мутация

Abstract

The aim of our study was to identify and describe the most common mutations, associated with multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) in Bulgaria and this way to help defining the individual therapeutic regiments for MDR-TB patient in the country. In TB National Reference Laboratory, National Center of Infectious and Parasitic Diseases (TB NRL, NCIPD) a total number of 222 MDR-TB strains from all over the country were tested, for eight-year period 2007 to 2014.

The most common mutation in rpoB gene, associated with resistance to Rifampicin, was S531L (86.49%). A characteristic feature of examined Bulgarian MDR-TB strains was the prevalence of С15Т (48.65%) in inhA gene, followed by S315T1 (26.13%) in katG gene. The most common gyrA mutation in MDR-TB strains with Fluoroquinolone resistance was A90V – 11.76% and 100% of the Aminoglycosides/Cyclic peptides resistant strains harbor the A1401G mutation in rrs gene.

Кey words: MDR-TB, LPA, mutation

Контролът на туберкулозата в световен мащаб продължава да е предизвикателство, особено след появата на MDR-TB в края на 20-и век и на екстензивнорезистентната туберкулоза (XDR-TB)  в началото на 21-и век.¹ Повече от 50 години след въвеждането на първото противотуберкулозно лекарство в практиката, туберкулозата остава водеща причина за смъртта и е животозастрашаващо заболяване в страните с нисък и среден доход, въпреки предприетите активни действия^2,3. От 27-те страни в списъка на СЗО с високо бреме на MDR-TB, 15 се намират в Европейския регион на СЗО и България е сред тях от 2009 г. до 2015 г.^{2, 4}.

MDR/XDR-TB като понятия бяха въведени в практиката от СЗО със следните определения: „MDR-TB се дефинира като туберкулоза, причинена от щам M. tuberculosis complex с доказана in vitro резистентност към Изониазид и Рифампицин едновременно, с или без наличие на резистентност към други противотуберкулозни лекарства от първи ред” и „(XDR-TB) се дефинира като туберкулоза, причинена от MDR-TB щам, с доказана in vitro резистентност към който и да е представител от групата на флуорохинолоните и към един или повече от следните инжекционни препарати: Канамицин, Амикацин и Капреомицин”⁵.

Резистентността на M. tuberculosis към противотуберкулозни лекарства в редки случаи се обуславя от наличието на механизми на вродена резистентност или се дължи на спонтанно възникнали хромозомни мутации. Факторите, водещи до резистеност, са следствие от грешки в режима на лечение: неадекватен, неправилно предписан или неспазван и т.н.^{6, 7}Проучването на конкретните мутации, асоциирани с MDR-TB, е от особена важност за терапевта, тъй като при откриване напр. на мутация в inhA гена, обикновено е налице ниско ниво на резистентност към Изониазид, т.е. щамът е чувствителност към по-високи дози Изониазид, както и кръстосана резистентност с Етионамид и Протионамид⁸.

Целта на настоящото микробиологично проучване бе да открием и опишем най-често срещаните мутации, асоциирани с мултирезистентната туберкулоза в България, сред фенотипно потвърдените MDR-TB щамове от цялата страна за осемгодишен период от време (от 2007 г. до 2014 г.), с което да подпомогнем определянето на индивидуалните терапевтични режими на MDR-TB пациентите.

Настоящото проучване беше осъществено в НРЛ ТБ, НЦЗПБ и обхваща 222 MDR-TB проби (щамове и клинични респираторни материали) от пациенти, суспектни за туберкулоза, от цялата страна. Те бяха изследвани и сравнени чрез два основни съвременни метода, официално препоръчани от СЗО за определяне на лекарствената чувствителност на M. tuberculosis complex: чрез автоматизирана система с течни хранителни среди за фенотипно отчитане и чрез молекулярно-генетични PCR базирани методи (линейно хибридизационни методи)⁹. На всички изолати беше осъществена видова идентификация за принадлежност към M. tuberculosis complex чрез имунохрамотографски тест (BD MGIT TBc Identification Test, BD, USA).

Използваният от нас фенотипен метод бе с автоматизираната система BАСТЕС^®MGIT 960 System (Becton Dikensоn, USA) – с течна хранителна среда MGIT и стандартизиран комерсиален кит (SIRE kit) към четирите основни лекарства: Стрептомицин 1,0µg/ml, Изониазид 0,1µg/ml, Рифампицин 1,0µg/ml и Етамбутол 5,0µg/ml. Критични концентрации на противотуберкулозните лекарства от втори ред бяха: Офлоксацин 2,0µg/ml, Амикацин 1,0µg/ml, Канамицин 5,0µg/ml и Капреомицин 2,5µg/ml.

Използваният от нас молекулярно-генетичен метод бе линейно хибридизационен (LPA): GenoType^®MTBDRplus (HAIN, Lifescience, Germany) – за определяне на резистентност към Рифампицин и Изониазид и GenoType^®MTBDRsl (HAIN, Lifescience, Germany) – за определяне на резистентност към флуорохинолони и аминогликозиди/циклични пептиди. С тях бяха тествани ДНК, изолирани от MDR-TB щамовете или директно от респираторните клинични материали, положителни на микроскопско изследване за киселинно устойчиви бактерии. Определянето на резистентността към Рифампицин се базира на отчитане на най-важните мутации в rpoB гена, кодиращ β-субединицата на РНК полимеразата. Отчитане на резистентността към Изониазид се базира на мутации в два гена: katG, кодиращ ензима каталаза пероксидаза, който активира Изониазида в микобактериалната клетка; и промоторът на региона на inhA, кодиращ NADH-зависима еноил-ACP редуктаза. Определянето на резистентността към флуорохинолони се основава на откриване мутации в gyrA гена, кодиращ ензима ДНК-гираза. Определянето на резистентността към аминогликозиди и циклични пептиди, се основава на мутации в  гена за 16S рРНК (rrs).

Генетично проучените 222 проби с GenoType^® MTBDRplus представляват 72,07% от фенотипно потвърдените 308 MDR-TB щама в НРЛ по туберкулоза през периода от 2007г. до 2014г. По-голямата част от тези 222 линейнохибридизационни теста са изработени с щамове  M. tuberculosis complex – 82,88% (n=184), а по-малка – директно от белодробни материали (спутум и бронхоалвеоларни лаважи), съответно 17,12% (n=38). От проучените по двата метода 222 изолата: 97,75% (n=217) бяха от спутум и 2,25% (n=5) от БАЛ.

За определяне на Рифампициновата резистентност, използваният от нас тест GenoType^® MTBDRplus обхващаща т. нар. гореща точка, кодони от 507 до 533 в активен участък, обозначаван като RRDR – „Rifampicin Resistance Determining Region”, от 81 bp на rpoB гена. На Таблица 1 са представени откритите от нас мутациите в rpoB гена, определени чрез генетичния тест  МTBDRplus, сравнен с фенотипния тест BACTEC MGIT.

Табл. 1. Сравнение на резултатите за Рифам­пи­ци­но­вата резистентност, получени чрез генетичен тест МTBDRplus, с тези чрез фенотипен тест BACTEC MGIT

Δ делеция; WT див тип; MUT мутация; R резистентен; S чувствителен

*Възможни мутации, точно разграничими чрез секвениране

В направеното от нас проучване на 222 MDR-TB щама с генетичния тест МTBDRplus установихме, че в 98,65% (n=219) има пълнo съвпадение между фенотипната резистентност на дадения изолат към Рифампицин (конвенционален BACTEC метод, обозначаван като „златен стандарт”), и тази от молекулярно-генетичния тест.

При отчитане на Рифампициновата резистентност на стрипa на MTBDRplus се интерпретират 8 сонди (WT1 до WT8), разпознаващи дивите мутации, и 4 сонди (rpoB MUT S531L, rpoB MUT H526Y, rpoB MUT H526D и rpoB MUT D516V), кореспондиращи с най-честите мутации: S531L, H526Y, H526D и D516V на rpoB. Според проучванията на Hillemann et al. през 2007г., при 96,8 до 98,7% от Рифампицин резистентни щамове са били свързани с мутации в rpoB гена¹⁰.

В нашето проучване само в 3 щама (1,38%) не се откриха мутации в RRDR региона на rpoB гена (Табл. 1). По литературни данни, по-малко от 5% от фенотипно резистентните щамове не показват мутация в тествания регион на rpoB гена^10,11.  Рядко мутации в локуси извън региона на горещата точка на rpoB са свързани с фенотипна резистентност. Мутациите, детерминиращи Рифампициновата резистентност в настоящото проучване, са с най-висока честота в кодон 531 и кодон 526 на rpoB гена, съответно 89,64% (n=199), и 4,96% (n=11). Останалите 12 Рифампицин резистентни щама бяха с други мутации с ниска честота – от 0,45% до 1,35%.

Други наши проучвания, публикувани през 2008 г. и 2013 г., макар и изследващи по-малък брой MDR-TB щамове от България, подкрепят получените резултати от изследваните 222 MDR-TB щама в настоящото проучване^12-14.По литературни данни, повече от 95% от Рифампицин резистентните М. tuberculosis имат мутация в специфичната зона RRDR^{15, 16}. Като най-често срещани се цитират мутации, засягащи кодони 531 и 526 (в 81% от случаите). Те обикновено водят до високо ниво на фенотипна резистентност, както и кръстосана резистентност с други рифамицини¹⁷. Мутациите в кодони 511, 516, 518 и 522 причиняват ниски нива на резистентност към Рифампицин, както и известна чувствителност към рифабутин според Zhang Y, et al., 2005¹⁵.

Определяне резистентността към Изониазид, чрез генетичния тест МTBDRplus е по-сложна от тази към Рифампицин, тъй като мутациите могат да бъдат локализирани в повече гени и региони. Чрез тестa се визуализират най-значимите и често срещани мутации, обуславящи резистентността към Изониазид, съответно в гените katG и inhA.

Резултатите от проучването на 222 доказани фенотипно MDR-TB изолата са представени в Табл. 2.

Табл. 2. Сравнение на резултатите за Изониазидовата резистентност, получени чрез генетичен тест МTBDRplus, с тези чрез фенотипен тест BACTEC MGIT

Δ делеция; WT див тип; MUT мутация; R резистентен; S чувствителен

Най-често наблюдаваната мутация в проучените от нас 222 щамa, асоциирана с резистентност към Изониазид, е тази само в inhA гена – 48,65% (n=108), следвана от мутация само в katG гена – 29,73% (n=66) и четири щама с мутации и в двата гена едновременно – 1,80%.

Съвпадението на резултатите от генетичния и фенотипния тест за определяне резистентността при Изониазид бе 80,18% (n=178). В 19,82% (n=44) от проучените 222 MDR-TB щама не бяха установени мутации в двата гена, най-често асоциирани с резистентност към Изониазид. Вероятно се касае за мутации в други гени, различни от тези, обхванати с използвания тест. Предходни наши публикации през 2008 г. и 2013 г, макар и изследващи по-малък брой MDR-TB щамове от България, подкрепят получените резултати от изследваните 222 MDR-TB щама в настоящото проучване^12-14. По данни на различни автори: от 50% до 95% от Изониазид резистентните щамове имат мутация в кодон 315 на katG гена; от 20 до 35% – в регулаторния регион на inhA гена и от 10 до 15% в ahpC-oxyR междугенен регион, често във връзка с мутация в katG гена, извън кодон 315^{10, 18}.

Ограниченията на използвания комерсиален молекулярен тест МTBDRplus произтичат от невъзможността да се обхванат всички възможни мутации, свързани с Изониазидовата резистентност, като са визирани най-честите мутации в katG гена и регулаторния регион на inhA гена.

Обобщените резултати за резистентност едновременно към Изониазид и Рифампицин на проучваните 222 фенотипно определени като MDR-TB изолата с представяне на всички установени от нас мутации или липсата им са показани в Табл. 3.

Табл. 3. Резултати за резистентността към Рифампицин и Изониазид от генетичен тест МTBDRplus и фенотипния тест BACTEC MGIT

Δ делеция; WT див тип; MUT мутация; INH^r Изониазид резистентен; RMP^r Рифампицин резистентен; S чувствителен

При генетичното изследване на 222 фенотипно определени като MDR-TB щама прави впечатление, че 44 от тях, според генетичния тест, са Изониазид чувствителни – 19,82%, т.е. са без мутации в katG и/или inhA едновременно или по отделно. От тези 44 Изониазид чувствителни, но фенотипно определении като MDR-TB щама, 2 освен чувствителни към Изониазид са чувствителни и към Рифампицин (0,90%) т.е. са без наличие на мутации в rpoB и katG и inhA едновременно. Те могат да бъдат предмет на по-нататъшни проучвания, чрез секвениране на генома им, с цел точното локализиране на мутациите, асоциирани с MDR-TB.

Получените от нас резултати при сравнение на генетични и фенотипни методи, представени по-горе: за Рифампицин 98,65% съвпадение и за Изониазид 80,18%, са напълно съпоставими с публикуваните мета-анализи за GenoType^®MTBDRplus и BACTEC MGIT на MDR-TB, представени обобщено на Табл. 4 (по Ling D.I., et al. 2008)¹⁹.

Табл. 4. Съпоставяне на резултатите за резистентност към Рифампицин и Изониазид чрез GenoType^®MTBDRplus и BACTEC MGIT от международни проучвания и получените от нас резултати.

На 136 от щамовете бе направен и MTBDRsl, определящ връзката на резистентността към втори ред противотуберкулозни лекарства със съответни генни мутации. Тези лекарства са с решаващо значение при определяне на конкретните терапевтични режими на MDR-TB пациентите, а именно: за перорално приложение – групата на флуорохинолоните (Офлоксацин и Моксифлоксацин) и за парентерално приложение – групата на цикличните пептиди (Капреомицин) и/или аминогликозидите (Канамицин и Амикацин).

В 71,32% (n = 97) не бяха открити мутации в gyr A и rrs т.е. MDR-TB щамовете са чувствителни към флуорохинолони и аминогликозиди/циклични пептиди, което в 100% съвпада с фенотипната характеристика на тези щамове (Таблица 5).

Табл. 5. Резултати за резистентността към флуорохинолони и аминогликозиди/циклични пептиди чрез генетичен тест МTBDRsl и фенотипен тест BACTEC MGIT

Δ делеция; WT див тип; MUT мутация; R резистентен; S чувствителен

FQ Флурохинолони; AG/CP Аминогликозиди/циклични пептиди; 

AMK  Амикацин; KAN Канамицин; CAP Капрeомицин;

*От 6-те щама, които са показали LPA чувствителност към Флуорохинолони, на фенотипния тест – 1 от тези щамове е бил Офлоксацин  резистентен, а останалите 5 са били чувствителни.

В останалите 28,67% (n=39) от изследваните MDR-TB щамове са отчетени следните 3 комбинации от мутации в двата гена едновременно или поотделно, асоциирани със съответната резистентност:

Група: FQ-R и AG/CP-S: резистентността е асоциирана с наличие на мутации само в gyr A гена, без мутации в rrs, т.е. в 13,25% (n=18). В тази група най-често срещаната мутация е A90V– 9,56% (n =13), следвана от D94A – 2,21% (n=3).

Група: FQ-S и AG/CP- R: резистентността е асоциирана с наличие на мутации само в  rrs гена, без мутации в gyr A гена, т.е. в 4,41% (n=6). В тази група единствената мутация е A1401G.

Група: FQ-R и AG/CP- R: резистентността е асоциирана с наличие на мутации едновременно в двата гена gyr A и rrs гена, т.е. в 11,04% (n=15). В тази група най-често срещаната комбинация от мутации е D94G и A1401G – 6,62% (n=9), следвана от  A90V и A1401G – 2,21% (n=3).

Представените два молекулярно-генетични теста за линейна хибридизация, чрез които бяха проучени генните мутациите на 222, респ. на 136 MDR-TB щама в България в рамките на 2 дни, могат да дадат точна и ясна представа за противотуберкулозните лекарства, които да се включат в индивидуалните режими на MDR-TB пациентите. Последвалите фенотипни антибиограми, за които е необходимо около 2 седмици, могат да внесат извести допълнения и корекции в терапията, ако това се налага. За първи път в България, през 2011 г., НРЛ ТБ въведе тестове за лекарствена чувствителност за втори ред противотуберкулозни лекарства и е единствената лаборатория у нас, сертифицирана от международни организации (INSTAND e.V. и WHO SRL TB) за осъществяването на фенотипните и генетични тестове за лекарствена чувствителност за първи и втори ред противотуберкулозни лекарства²⁰.

От проучените 222 MDR-TB щама в НРЛ ТБ, НЦЗПБ, изолирани от пациенти, суспектни за туберкулоза, за осемгодишен период от време, от 2007 г. до 2014 г., на територията на цялата страна бяха открити и описани най-честите генни мутации, асоциирани с резистентността на M. tuberculosis complex към първи ред противотуберкулозни лекарства. Най-често срещаната мутация в rpoB гена, определяща резистентност към Рифампицин бе S531L в  86,49%. Характерна особеност за проучените български щамове е, че за Изониазид преобладава мутацията С15Т (48,65%) в inhA гена, асоциирана с ниско ниво на резистентност към Изониазид, следвана от katG гена – S315T1 (26,13%).

От проучените общо 136 MDR-TB щама за наличие на ген­ни мутации, асоциирани с резистентността на M. tuberculosis complex към втори ред противотуберкулозни лекарства, в 71,32% не бяха открити мутации в gyr A и rrs. Най-честата мутация в gyrA гена при резистентните към флуорохинолони бе А90V (11,76%), а за резистентните към аминогликозиди и циклични пептиди мутацията А1401G в  rrs гена открихме в 100% от случаите.

Направените изследвания бяха извършени благодарение на безвъзмездно предоставените консумативи, реактиви и тестове, по програми, финансирани от Глобалния Фонд за борба със СПИН, туберкулоза и малария: BUL-607-G02-T, BUL-809-G03-T

Литература

1. Gandhi NR, Moll A, Sturm AW, et al.. Extensively drug-resistant tuberculosis as a cause of death in patients co-infected with tuberculosis and HIV in a rural area of South Africa. www.thelancet.com Published online October 26, 2006 DOI: 10.1016/S0140-6736 (06) 69573-1.
2. World Health Organization. Global tuberculosis report 2015. WHO/HTM/TB/2015.22. Geneva, Switzerland.
3. European Centre for Disease Prevention and Control/WHO Regional Office for Europe. Tuberculosis surveillance and monitoring in Europe 2016. Stockholm.
4. А Ministerial Meeting of High M/XDR-TB countries, Meeting Report, Beijing, 2009, http://whqlibdoc.who.int/hq/2009/WHO_HTM_TB_2009.415_eng.pdf.
5. Manissero D, Fernandez de la Hoz K. Surveillance methods and case definition for extensively drug resistant TB (XDR-TB) and relevance to Europe: summary update. Euro Surveill. 2006;11(44):pii=3070.
6. Османлиев Д, Стефанова Д, Минчев П, и съавт. Методическо указание за терапевтично поведение при резистентна туберкулоза, МЗ, Програма „Подобряване на устойчивостта на националната програма по туберкулоза”, 2016, 1-102.
7. WHO. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis, Geneva, 2008, 237 p.
8. The PIH Guide to the Medical Management of Multidrug-resistant Tuberculosis, 2^nd Edition. Partners in Health. Boston, USA. USAID TB CARE II. 2013, 16-33.
9. Османлиев Д, Стефанова Д, Минчев П, и съавт., Методическо указание за микробиологична диагностика на туберкулозата, МЗ, Програма „Подобряване на устойчивостта на националната програма по туберкулоза”, 2016, 1-122.
10. Hillemann D, Rusch-Gerdes S, and Richter E. 2007. Evaluation of the GenoType MTBDRplus assay for rifampin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens. J Clin Microbiol 45:2635-2640.
11. Mani C, Selvakumar N, Narayanan S, et al., 2001. Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India. J Clin Microbiol 39:2987-2990.
12. Miotto P, Cuna Z, Dembele S, et al. Frequency of mutations among MDT/XDR-TB strains in different geographical settings, 29 congress of ESM, Plovdiv, Bulgaria, 06.- 09.07.2008. OP-16.
13. Бачийска Е, Йорданова С, Атанасова Ю, и съавт., Фенотипна и генетична характеристика на туберкулозните щамове, причинители на мултирезистентната туберкулоза в България през 2011г., In Spiro, бр. 1, март 2013, 38-41.
14. Yordanova S, Bachiyska E, Atanasova Y, et al. Multidrug resistant tuberculosis in Bulgaria-microbiological aspects, Probl. Inf. Paras. Dis., Vol. 41, Num. 1/2013, 5- 8.
15. Zhang Y and Jacobs W, 2005. Mechanisms of Drug Resistance in Mycobaterium tuberculosis. Tuberculosis and the Tubercle Bacillus. ASM Press, Washington, D.C., 115-140.
16. Telenti, A, Imboden P, Marchesi F, et al., 1993. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet 341:647-650.
17. Riska, P. F., Jacobs W. R., and Alland D. 2000. Molecular determinants of drug resistance in tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 4:S4-10.
18. Mokrousov, I, Narvskaya O, Otten T, et al., 2002. High prevalence of KatG Ser315Thr substitution among isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from northwestern Russia, 1996 to 2001. Antimicrob Agents Chemother 46:1417-1424.
19. Ling DI, Zwerling AA and Pai M. Geno Type MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analysis, Eur respire J 2008,9,32,1165-1174.
20. Yordanova S, Bachiyska E, Atanasova et al. MDR-TB with additional fluoroquinolone resistance in Bulgaria, Probl. Inf. Paras. Dis., Vol. 43, Num. 2/2015, 8-11.