Микробиологията на детската кашлица в клопката на антибиотичната резистентност

Резюме 

Инфекциите на дихателните пътища (ИДП) са едни от най-честите причини за търсене на лекарска помощ, но и едни от най-предизвикателните заболявания от гледна точка на правилно взимане на клинични решения, особено когато се касае за детската популация. Несъмнено навлизането на молекулярната диагностика, включително комбинирани PCR панели за най-честите респираторни патогени (вируси, бактерии, включително атипични и специфични) и бързи антигенни тестове са съществено предимство в диагностиката на респираторните инфекции. Въпреки това традиционното бактериално културелно изследване продължава да бъде златен стандарт за изолиране и детекция на респираторни патогени от горните и долните дихателни пътища. За периода ноември 2022 – март 2023 към СМДЛ „Велинов Диагностика“ за микробиологично изследване на материал от горни и долни дихателни пътища (носен, гърлен, дълбок гърлен секрет и храчка) са насочени 180 деца (107 момчета и 73 момичета) на възраст от 6 месеца до 16 години. От взетите проби са изолирани 48 щама H. influenzae, 23 M. catarrhalis и 18 S. pneumoniae. Прави впечатление значимото ниво на Spn резистентност към макролиди (азитромицин, кларитромицин), клиндамицин и триметоприм-сулфаметоксазол. Това наблюдение заедно с природната нечувствителност на Hflu към макролиди поставя под сериозно съмнение започването на емпирично лечение с тази група антибиотици като първа линия в доболничната помощ. Точната и навременна диагноза на респираторните инфекции е от критично значение за назначаването на оптимална терапия и предотвратяването на по-нататъшна антибиотична резистентност в резултат на неправилно или ненужно антибиотично лечение.

Ключови думи – бактериални респираторни патогени, Инфекциите на дихателните пътища (ИДП), деца, антибиотична резистентност, биофилм

Инфекциите на дихателните пътища (ИДП) са едни от най-честите причини за търсене на лекарска помощ, но и едни от най-предизвикателните заболявания от гледна точка на правилно взимане на клинични решения, особено когато се касае за детската популация.¹ ИДП са и най-смъртоносните сред заболяванията с инфекциозна етиология, като представляват четвърта водеща причина за смъртност в световен мащаб с докладвани 2 603 913 летални случая годишно за 2019 година^2,3. Точната и навременна диагноза е от критично значение за назначаването на оптимална терапия и предотвратяването на по-нататъшна антибиотична резистентност в резултат на неправилно или ненужно антибиотично лечение.

Диагностичният процес e динамичен процес, включващ три неразделни елемента – клинична оценка с интерпретация на клиничния профил и предвиждане на най-вероятното заболяване, етиологична диагноза с дефиниране и анализ на причинителя и оценка на прогнозата с предвиждане на вероятния курс на заболяването и необходимостта от проследяване и неговата продължителност¹. Идентифицирането на патогена и оценката на неговата чувствителност, както и правилната оценка на показателите за имунен отговор на гостоприемника (CRP, прокалцитонин, левкоцити, диференциално броене, СУЕ, фибриноген, специфични биомаркери) в контекста на клиничната картина, общото състояние и хода на заболяването, са от ключово значение за предприемането на правилно терапевтично поведение.

Несъмнено навлизането на молекулярната диагностика, включително комбинирани PCR панели за най-честите респираторни патогени (вируси, бактерии, включително атипични и специфични) и бързи антигенни тестове са съществено предимство в диагностиката на респираторните инфекции. Недостатък на тези тестове е невъзможността за проверка на бактериалната чувствителност. Поради това традиционното бактериално културелно изследване (изолиране и антибиограма) продължава да бъде златен стандарт за детекция на респираторни патогени от горните и долните дихателни пътища. Колонизацията от S. pneumoniae (Spn), H. influenzae (Hflu) и M. catarrhalis (Mcat) в назофаринкса е основна стъпка в патогенезата на респираторните заболявания⁴. Типа, разпространението и плътността на колонизацията се влияят от различни рискови фактори (околна среда, гъстота на домакинството, детска възраст, кърмене, посещаване на заведения за дневни грижи, употреба на антибиотици, излагане на фини прахови частици и пр.). Назофарингеалната колонизация е конкурентна, може да доведе до инфекция, но също така може да бъде асимптоматична и да е имунизиращо събитие (да повлияе на имунните отговори към ваксини). Ранната възраст на първата колонизация със Spn, Hflu и Mcat е свързана с предразположение към инфекции и астма, а ранната колонизация с Mcat е отрицатело свързана с биоразнообразието на назофарингеалния микробиом. Децата, предразположени към инфекции от тези бактерии, се колонизират по-рано и реагират на колонизацията с по-ниски нива на антитела.⁴

Клинично наблюдение – собствен опит

За периода ноември 2022 – март 2023 към СМДЛ „Велинов Диагностика“ за микробиологично изследване на материал от горни и долни дихателни пътища (носен, гърлен, дълбок гърлен секрет и храчка) са насочени 180 деца (107 момчета и 73 момичета) на възраст от 6 месеца до 16 години. Водещи диагнози при изследваната група деца са остра инфекция на горните дихателни пътища с протрахирана хрема (31) и синуит (15), аденоидит/тонзилит (7), остър ларинготрахеит (5), остър бронхит или бронхиолит (35), протрахиран бактериален бронхит (ПББ – 26), както и деца с продължителна суха кашлица и съмнение за респираторна алергия (19), такива с новодиагностицирана или известна бронхиална астма с влошен контрол (38), грип А (2), дисфункционално дишане (2). Изследваните деца са селектирана група пациенти, насочени за микробиологично изследване от тесен специалист – детски пулмолог, а водеща причина за консултацията е кашлица с различен характер и давност.

От взетите проби са изолирани 48 щама H. influenzae, 23 M. catarrhalis и 18 S. pneumoniae сред изследваната популация деца с респираторни симптоми (виж таблица 1). Чувствителността на изолатите към антимикробни средства е представена в табл. 1. Прави впечатление значимото ниво на Spn с резистентност към макролиди (азитромицин, кларитромицин), клиндамицин и триметоприм-сулфаметоксазол. Това наблюдение, заедно с природната нечувствителност на Hflu към макролиди, поставя под сериозно съмнение започването на емпирично лечение с тази група антибиотици като първа линия в доболничната помощ.

Табл. 1: % чувствителни изолати

Легенда: AMC, Amoxicillin-clavulanate; Cef. II g, цефалоспорини 2-ра генерация; Cef. III g, цефароспорини 3-та генерация; Clarithro., Clarithromycin; Azithro., Azithromycin; Clinda., Clindamycin; Levo.,Levofloxacin; TMP-SMX, trimethoprim-sulfamethoxazole; Rif., Rifampin

Микробиологична и клинична характеристика на основните бактериални изолати

Haemophilus influenzae е опортюнистичен патоген, който може да причини инфекции с различни клинични симптоми, включително отит на средното ухо, епиглотит, синузит и пневмония, особено при деца. Предаването на H. influenzae става предимно при директен контакт с респираторни капчици от фарингеални носители. Без навременно и ефективно лечение инфекцията може да доведе до животозастрашаващи усложнения, като бактериемия и менингит. Бактериемията от своя страна може да доведе до ампутация на крайници. Освен това до 30% от преживели менингит страдат от трайна загуба на слуха или други дългосрочни неврологични усложнения. Приблизително 5% от инвазивните инфекции с H. influenzae при деца са фатални. Тенденцията хемофилите да изместят пневмокока, като водещ причинител на инфекции в респираторния тракт, бе забелязана за първи път преди 20 години в детската оториноларингология. През следващите години тази тенденция се утвърди и за други инфекции в респираторния тракт и се наблюдава в страни с широко използване на Spn конюгирани ваксини.

Streptococcus pneumoniae е най-честият причинител на пневмонии, придобити в обществото, при деца и възрастни и според Световната здравна организация е основна причина за смъртност при деца до пет години. Пневмококите притежават различни фактори на вирулентност, които им дават възможност да се прикрепват към епителните клетки и да преминават през тях. Клетъчната стена на вирулентните щамове е покрита с капсула, която ги предпазва от фагоцитоза. Съществува голямо разнообразие от капсулни антигени и до момента са описани повече от 100 серотипа. В резултат на широката употреба на пневмококовата конюгирана ваксина се съобщава за промяна в доминиращите серотипове. 13 серотипа (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F& 23F) са отговорни за около 80% – 90% от тежко протичащите педиатрични инфекции.

Moraxella catarrhalis е опортюнистичен патоген, който се наблюдава като суперинфекция по време на риновирусни заболявания и екзацербации на астма и е свързан с по-тежко протичане на заболяването. Доказано бе, че риновирусната инфекция насърчава адхезията и преживяването на M. catarrhalis върху респираторния епител, както и усилва възпалителните реакции.

В клопката на антибиотичната резистентност – „персистъри“ и биофилми

Антибиотичната резистентност е огромна заплаха за здравето на хората по света. Тя оказва влияние върху заболеваемостта, продължителността на болничния престой, разходите за здравеопазване и е независим фактор за летален изход. Скорошно проучване оповести стряскащи данни относно смъртните случаи, дължащи се на антибиотична резистентност (АР) и смъртни случаи, свързани с АР за 2019 година (годината преди Covid-19)⁵. Смъртността, свързана с АР, е изчислена на 4,95 милиона души, а 1,27 милиона са загубили живота си пряко от резистентни бактерии. Това поставя микробната резистентност на трето място като водеща причина за смърт след исхемичната болест на сърцето и инсулта. Инфекциите на долните дихателни пътища са отговорни за повече от 1,5 милиона смъртни случаи, свързани с резистентност, което ги прави най-опасният инфекциозен синдром⁵. Използването на алгоритми за лечение доведе до по-ниски нива на смъртност. Въпреки това, бъдещето на този подход е несигурно, предвид бързото развитие и разпространение на антибиотичната резистентност. Едни от най-засегнатите са респираторните патогени, като следствие от неправилната и/или свръхупотреба на антимикробни препарати, както в обществото, така и в болниците.

Една от характерните черти на бактериалните клетки е възможността им да изпадат в латентно състояние, при което всички процеси на растеж, развитие и размножаване се преустановяват. В това си състояние бактериите на практика не се повлияват от антибиотиците, независимо от дозата, без да са развили някакъв тип резистентност. Преминавайки от латентно във витално състояние, тези бактерии водят до възобновяване на симптоматиката на заболяването и при това те остават чувствителни на антибактериалните средства. Като следствие – протрахиране на заболяването, допълнително прилагане на антибиотици, повишен риск от развитие на резистентност. Това състояние на бактериите се определя като „persisters“ (устойчиви, такива, които преживяват).

„Персистърите“ обикновено ги свързваме с бактериалният биофилм – уседналата форма на живот при бактериите. През последните 30 – 40 години бактериите бяха категоризирани в две различни форми на живот. При първата (планктонна) форма – бактериите изглеждат като единични, независими свободно плаващи клетки (планктон). В другата форма бактериите са организирани в повърхностно прикрепени неподвижни агрегати (биофилми). Освен това агрегираните бактерии се разделят на повърхностно прикрепени и свободно плаващи агрегати, като думата биофилм произхожда от биоматериала, отложен върху дадена повърхност.

В медицината доскоро бактериите, растящи планктонно, се свързваха с остро протичащи инфекции, които обикновено се лекуват успешно с антибиотици, въпреки че успешното лечение до голяма степен зависи от точната и бърза диагноза. В случаите, когато бактериите успеят да образуват биофилми в гостоприемника, инфекцията често хронифицира и поддържа нискостепенно възпаление⁶. Тази догма бе оспорена неотдавна с откритието, че разликата между бактериите при остри и хронични инфекции е метаболитната активност, а не агрегацията⁷. Биофилмовите инфекции могат да бъдат свързани с повърхности (пациенти с импланти или медицински устройства) и несвързани с повърхност, като инфекции на дихателните пътища, при които мукоцилиарният клирънс на гостоприемника е нарушен или при персистиращи инфекции на меките тъкани, свързани със съпътстващи заболявания като диабет, или нарушена васкуларизация, водеща до незарастващи рани.

Биофилмът като самостоятелна микроекосистема – организация, комуникация и поведение на бактериалните клетки

Основна характеристика на биофилма е подчертаната резистентност към антибиотична терапия поради обмяната на генетичен материал между инфекциозните причинитeли и наличието на полимерен матрикс около бактериалните клетки. Матриксът протектира клетките вътре в биофилма и спомага на взаимодействието помежду им. Бактериалните клетки в биофилма комуникират помежду си чрез химически сигнал, който е известен като кворум (QS). Образуването на биофилм се регулира от различни генетични фактори и фактори на околната среда. Генетичните изследвания показват, че бактериалната мобилност, протеините на клетъчната мембрана, извънклетъчните полизахариди и сигналните молекули играят значителна роля в образуването на биофилм. Подвижността на бактериите се осигурява от два вида протеинови израстъци на клетъчната повърхност, флагели и фимбрии. Бактериална подвижност е необходима за установяване на връзката между бактериите и повърхността, докато подвижността, активирана от фимбриите, е необходима за образуването на микроколонии. Стабилната връзка между бактериите и повърхността на субстрата се поддържа от специфични протеини на клетъчната мембрана, адхезини. Ако активността на адхезина е инхибирана, няма образуване на биофилм. Значителна роля в изграждането на биофилма играе извънклетъчната полизахаридна матрица (EPS), като активирането на гените, необходими за синтеза ѝ, се извършва след установяване на стабилна връзка между бактериите и повърхността на субстрата⁸. Интерактивната комуникация чрез сигнални молекули позволява на бактериите да се организират в общност, така че биофилмът да функционира като много-клетъчен организъм. Различни сигнали от околната среда, като наличието на определени хранителни вещества, на кислород, температура и pH, участват в регулирането на образуването на биофилм.

Основните структурни единици на биофилма са микроколонии, отделни общности от бактериални клетки, вградени в EPS матрица. Тези микроколонии в повечето случаи са гъбовидни или пръчковидни и могат да се състоят от един или повече видове бактерии⁹. В зависимост от вида на бактериите, микроколониите са представени от 10 – 25% клетки и 79 – 90% EPS матрица. EPS матрицата защитава клетките на биофилма от различни негативни условия на околната среда, като UV радиация, резки промени в pH стойностите, дрениране. Между микроколониите има канали, през които тече вода. Тези водни канали функционират в биофилм като проста кръвоносна система, разпределяща хранителни вещества към микроколониите и получаваща вредни метаболити. Биофилмът е полиморфен и може да коригира структурата си в зависимост от промените в околната среда. Когато концентрацията на глюкоза е висока, микроколониите растат бързо и дебелината на биофилма се увеличава значително.

Благодарение на напредъка в молекулярната генетика, днес разполагаме с данни за архитектурата на биофилма, метаболитните взаимодействия, филогенетичните групи в него, комуникацията, конкуренцията и сътрудничеството помежду им. Разкрити бяха големи разлики в транскриптонните профили на планктонните и сесилните биофилмни бактериални клетки, като броят на гените се променя и варира от двадесет до няколкостотин. Освен това са докладвани промени в сигнализирането от клетка към клетка, експресията на вирулентни гени и биосинтезата на компоненти на матрицата¹⁰. Invitro модели показаха, че биофилмите са хетерогенни и бактериите са строго разпределени в отделните части на биофилма, отделят различни метаболити и извънклетъчни сигнални молекули, което води до модулиране на метаболитните им скорости, латентност, реакции на стрес и нива на мутация. Наблюдавани са големи разлики в микросредата на отделните биофилми в зависимост от това дали бактериите са в непосредствена близост до растежната среда или са уловени в някакъв вид биологичен (напр. слуз, подлежаща инфектирана тъкан) материал. Микросредата играе водеща роля за метаболизма на бактериите, толерантност към антибиотици, темп на растеж и експресия на вирулентни фактори¹¹.

Междуклетъчната комуникация на бактериалните клетки (quorumsensing) се осигурява от извънклетъчни сигнални молекули, автоиндуктори. Натрупването на сигнални молекули в средата позволява на всяка една бактериална клетка да оцени общия брой бактерии, тоест клетъчната плътност. Това явление е известно като кворум разпознаване. При точно определена критична клетъчна плътност концентрацията на автоиндукторите в средата достига нивото, необходимо за активиране на специфични целеви гени. Вирулентността на много човешки патогени се регулира от quorumsensing. За да се избегне активирането на имунната система на гостоприемника, патогенните бактерии координират своята вирулентност, като отлагат производството на вирулентни фактори, докато бактериалната популация стане достатъчно голяма, за да причини инфекция.

Предполага се, че бавният растеж на определени субпопулации от клетки в рамките на биофилма и преминаването им в стационарна фаза е следствие от обща реакция на стрес, регулаторен механизъм, който позволява на бактериите да оцелеят при неблагоприятни условия на околната среда. Персистерите са част от бактериални клетки, устойчиви на терапевтична антибиотична концентрация. При третиране с антибиотици повечето планктонни клетки се унищожават, както и повечето клетки от биофилма, а малката популация от планктонни персистери, останали след лечението, се унищожават от имунната система на гостоприемника, така че да не представлява клиничен проблем. Въпреки това, за разлика от планктонните персистери, персистерите на биофилма са защитени от имунната система чрез полизахаридна матрица, те са отговорни за високата устойчивост на биофилма към разрушаване. Когато концентрацията на антибиотиците намалее, персистерите възстановяват биофилма, който след това започва да освобождава нови планктонни клетки. Тази динамика обяснява рецидивиращия характер на инфекциите с биофилм.¹² Бактериите в биофилма са 10 – 1000 пъти по-устойчиви на антибиотици от планктонните клетки, но техният механизъм на резистентност все още не е изяснен⁸.

Антибиотична защита на бактериалния биофилм

Досега са формулирани три хипотези в опит да се обясни резистентността на биофилма към антибиотици.

Първата хипотеза се основава на бавната или непълна дифузия на антибиотиците във вътрешните слоеве на биофилма. Проучвания върху биофилма на P. aeruginosa показват, че полимерни вещества в матрицата с отрицателен заряд се свързват с антибиотици с положителен заряд, като по този начин намаляват тяхната дифузия¹³. Проникването на антибиотици в биофилма на Klebsiella pneumoniae е ограничено поради дезактивирането на антибиотиците, което се случва във външните слоеве на биофилма. Този процес протича с по-висока скорост от дифузията.

Втората хипотеза се основава на промените, които настъпват в микросредата на биофилма. Според тази хипотеза някои бактерии от биофилм изпадат в състояние на бавен растеж поради липса на хранителни вещества или натрупване на вредни метаболити и следователно оцеляват.

Според третата хипотеза, досега само теоретична, в биофилма има субпопулация от клетки, чиято диференциация наподобява процеса на образуване на спори. Тази субпопулация има уникален, силно резистентен фенотип, който ги предпазва от ефектите на антибиотиците. Този фенотип не се развива в резултат на недостатъчно осигуряване на хранителни вещества, той е биологично програмиран отговор на уседналата форма на живот на бактериите⁹.

Прилагането на различни молекулярно-биологични и микроскопични техники доказа, че бактериите в биофилма са физиологично хетерогенни, което е много важно за резистентността към антибиотици⁶. Всъщност, благодарение на голямото разнообразие от метаболитни етапи, съжителстващи в биофилма, оцеляването на определен брой клетки е осигурено в случай на метаболитна заплаха за биофилма.

Стратегии за борба с биофилм инфекциите

Появиха се и различни стратегии за превенция и контрол на биофилма. Образуването на биофилм може да бъде предотвратено чрез сигнални молекули, които блокират прикрепването на бактериални клетки към повърхността на субстрата и чрез химически реакции, които предотвратяват синтеза на полимери в извънклетъчния матрикс⁷. Веществата, които блокират комуникацията между бактериите, могат да предотвратят образуването на биофилм или да стимулират неговото разпръскване. Дисперсията на биофилма може да бъде предизвикана от ензими, които разграждат полимерите в извънклетъчния матрикс⁷. За да се разработят нови лечения за унищожаване на биофилм, е изключително важно да се продължат изследванията върху механизмите, които водят до повишена устойчивост на биофилма към антимикробни агенти.

Бъдещи насоки 

Солидните доказателства за съществуването на белодробен микробиом оспориха традиционните разбирания за патогенезата на респираторните инфекции. Концепцията, че здравият бял дроб на практика не е стерилен орган, промени значително интерпретация на етиологичните диагностични изследвания¹⁴. Бъдещето в диагностиката на респираторните инфекции трябва задължително да имплементира познанията за белодробния микробиом, организацията, комуникацията и поведението на бактериалните клетки, способността им да формират биофилм, както и вирус-бактериалните взаимодействия.¹⁵ По отношение на диагностиката на инфекциите на долните дихателни пътища фокусът постепенно ще се измества от откриването на специфични патогени към оценката на специфични маркери за оценка на промяната в белодробната микробна екология динамично в хода на заболяването.¹⁶

Заключение

Точната и навременна диагноза на респираторните инфекции е от критично значение за назначаването на оптимална терапия и предотвратяването на по-нататъшна антибиотична резистентност в резултат на неправилно или ненужно антибиотично лечение. Периодичният контрол и оценка на бактериалната антибиотична чувствителност е от съществено значение при избора на емпирично антибиотично средство в доболничната помощ. Резултатите от настоящото клинично наблюдение демонстрират обезпокоителна тенденция за компроментирана чувствителност към макролиди (азитромицин, кларитромицин), клиндамицин и триметоприм-сулфаметоксазол на един от най-честите бактериални патогени при деца и възрастни, а именно S. pneumoniae. Това в комбинация с нарастващото разпространение на нетипируеми H. Influenzae, след масовото въвеждане на конюгираните ваксини, следва да постави под сериозно съмнение започването на емпирично лечение с макролиди като първа линия в доболничната помощ. Динамичната ситуация с антибиотичната резистентност налага провеждането на микробиологична диагностика и продължаване на лечението съобразно антибиотичната чувствителност на изолирания патоген.

Литература:

1. Stojanovic, Z.; Gonçalves-Carvalho, F.; Marín, A.etal.Advances in Diagnostic Tools for Respiratory Tract Infections: From Tuberculosis to COVID-19 – Changing Paradigms? ERJ Open Res. 2022, 8 (3), 00113–02022. https://doi.org/10.1183/23120541.00113–2022.
2. WHO The Global Health Observatory. Global Health Estimates: Leading Causes of Death. Cause-Specific Mortality, 2000 – 2019. Available online: https://www.who.int/data/gho/data/themes/mortality-and-global-health-estimates/ghe-leading-causes-of-death.
3. Mirsaeidi, M.; Motahari, H.; Taghizadeh Khamesi,et al.Change and Respiratory Infections. Ann. Am. Thorac. Soc. 2016, 13 (8), 1223 – 1230. https://doi.org/10.1513/AnnalsATS.201511 – 729PS.
4. Kaur, R.; Pichichero, M. Colonization, Density, and Antibiotic Resistance of Streptococcus Pneumoniae , Haemophilus Influenzae , and Moraxella Catarrhalis among PCV13-Vaccinated Infants in the First Six Months of Life in Rochester, New York: A Cohort Study. J. Pediatric Infect. Dis. Soc.2023. https://doi.org/10.1093/jpids/piad004.
5. Murray, C. J. L.; Ikuta, K. S.; Sharara, F.;et al. Global Burden of Bacterial Antimicrobial Resistance in 2019: A Systematic Analysis. Lancet 2022, 399 (10325), 629–655. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02724-0.
6. Lebeaux, D.; Chauhan, A.; Rendueles, et al.From in Vitro to in Vivo Models of Bacterial Biofilm-Related Infections. Pathog. (Basel, Switzerland) 2013, 2 (2), 288 – 356. https://doi.org/10.3390/pathogens2020288.
7. Sauer, K.; Stoodley, P.; Goeres, D. M.; et al.The Biofilm Life Cycle: Expanding the Conceptual Model of Biofilm Formation. Nat. Rev. Microbiol. 2022, 20 (10), 608 – 620. https://doi.org/10.1038/s41579-022-00767-0.
8. Pamp, S. J.; Sternberg, C.; Tolker-Nielsen, T. Insight into the Microbial Multicellular Lifestyle via Flow-Cell Technology and Confocal Microscopy. Cytometry. A 2009, 75 (2), 90 – 103. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20685.
9. Wu, B. C.; Haney, E. F.; Akhoundsadegh, N.; et al.Human Organoid Biofilm Model for Assessing Antibiofilm Activity of Novel Agents. NPJ biofilms microbiomes 2021, 7 (1), 8. https://doi.org/10.1038/s41522-020-00182-4.
10. Rumbo-Feal, S.; Gómez, M. J.; Gayoso, C. et al.Transcriptome Analysis of Acinetobacter Baumannii Assessed by RNA-Sequencing Reveals Different MRNA Expression Profiles in Biofilm Compared to Planktonic Cells. PLoS One 2013, 8 (8), e72968. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072968.
11. Cornforth, D. M.; Dees, J. L.; Ibberson, C. B.; et al. Pseudomonas Aeruginosa Transcriptome during Human Infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115 (22), E5125–E5134. https://doi.org/10.1073/pnas.1717525115.
12. Zhang, X.; Wu, X.; Nong, G. Update on Protracted Bacterial Bronchitis in Children. Ital. J. Pediatr. 2020, 46 (1), 38. https://doi.org/10.1186/s13052-020-0802-z.
13. Valentini, M.; Filloux, A. Biofilms and Cyclic Di-GMP (c-Di-GMP) Signaling: Lessons from Pseudomonas Aeruginosa and Other Bacteria. J. Biol. Chem. 2016, 291 (24), 12547–12555. https://doi.org/10.1074/jbc.R115.711507.
14. Dickson, R. P.; Erb-Downward, J. R.; Martinez, F. J.; et al.The Microbiome and the Respiratory Tract. Annu. Rev. Physiol. 2016, 78 (1), 481–504. https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-021115-105238.
15. Dickson, R. P.; Huffnagle, G. B. The Lung Microbiome : New Principles for Respiratory Bacteriology in Health and Disease. 2015, 1–5. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004923.
16. Murdoch, D. R.; Werno, A. M.; Jennings, L. C. Microbiological Diagnosis of Respiratory Illness. In Kendig’s Disorders of the Respiratory Tract in Children; Elsevier, 2019; pp 396-405.e3. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-44887-1.00022-5.