Резюмe
Цел на проучването е да бъдат представени видовете нетуберкулозни микобактерии (NTM), изолирани от респираторни клинични материали на пациенти от цялата страна. Проучването обхваща петгодишен период – от 2007 до 2011 г., и е осъществено в Националната Референтна лаборатория по туберкулоза, Национален център по заразни и паразитни болести (НРЛ ТБ, НЦЗПБ). За идентификацията на 127 изолата NTM са използвани физични, биохимични, имунохроматографски и молекулярногенетичните тестове GenoType® CM/AS. Като M. fortuitum complex са определени 37 изолата, 33 – M. gordonae, 11 – M. lentiflavum, 9 – M. avium complex, 6 – M. chelonae, 5 – M. kansasii, 2 – M. Mucogenicum, 1 – M. scrofulaceum и 1 – M. celatum. До родова принадлежност са идентифицирани 18 щама (Mycobacterium spp.)
Ключови думи: NTM, видова идентификация, LPA
The aim of the study was to reveal the species of Non Tuberculosis Mycobacteria (NTM) in clinical respiratory isolates of patients from all over the country. The study covered five years period – from 2007 to 2011 and it was conducted in the National Reference Laboratory of Tuberculosis, National Center of Infectious and Parasitic Diseases (NRL TB, NCIPD). Using physical, biochemical, immunochromatographic tests and the molecular tests: GenoType® CM/AS, the amount of 127 NTM clinical isolates were identified as follows: M. fortuitum complex – 37, M. gordonae – 33, M. lentiflavum – 11, M. avium complex – 9, M. chelonae – 6, M. kansasi – 5, M. mucogenicum – 2, M. scrofulaceum – 1 and M. celatum – 1 isolate. There were 18 strains that were identified to genus level only (Mycobacterium spp).
Key words: NTM, species identification, LPA
Нетуберкулозните микобактерии, наброяващи днес повече от 140 вида, принадлежат към род Mycobacterium1,2,3. За разлика от добре познатите причинители на специфичните заболявания туберкулоза (M. tuberculosis) и проказа (М. leprae), останалите микобактерии от род Mycobacterium, наричани още атипични, анонимни, нетуберкулозни микобактерии (NTM) или микобактерии, различни от туберкулозните (MOTT), са обикновено сапрофити. В някои случаи те могат да бъдат опортюнисти и дори смъртоносни патогени. Тези микобактерии са причинители на т.нар. микобактериози – локализирани или дисеминирани заболявания, главно при имунокомпрометирани пациенти. Изолацията им от репрезентативни материали и бързата им идентификация е от изключително значение за пациента, тъй като терапията при туберкулозата и при останалите микобактериози е различна4.
NTM са обитатели на околната среда – вода и почва. Te са изключително хетерогенна група киселинно устойчиви бактерии, класифицирани в 4 големи групи въз основа на фотореактивност, температурен диапазон и бързина на растеж (Таблица 1).
Таблица 1: Работна класификация на NTM
Обикновено заразяването на човека се осъществява от околната среда. Не са доказани случаи на трансмисия от човек на човек и от животно на човек4. Увеличаването на случаите на микобактериози се свързва както с по-интензивното взаимодействие на човек с околната среда, така и с популационни и демографски промени, включително увеличаване на броя на имуносупресираните в резултат на вируса на СПИН, злокачествени заболявания или медицински интервенции10,14. Понастоящем най-малко 60 вида NTM причиняват заболявания при човек с различна тежест и прогноза5.
Инфекциите, причинени от NTM, могат да бъдат представени в няколко групи: хронични белодробни болести – асоциирани с бронхиектазии, следтуберкулозна пневмосклероза, силикоза; лимфаденити – на субмандибуларните, цервикалните, периаурикуларните лимфни възли, най-често при деца от 1 – 5г.; кожни и мекотъканни инфекции, свързани с инокулиране на NTM от околната среда (swimming pool granuloma, fish tank granuloma, Buruli ulcer), наранявания с градинарски инструменти, бодлива тел и др.); инфекции, свързани със здравната грижа – при катетеризации, в пластичната хирургия, при инжектиране на лекарства, контаминиране на медицински инструментариум (бронхоскопи); инфекции на стави, връзки, кости след травми, хирургически инцизии, прободни рани, инжекции; дисеминирани форми при имуносупресирани пациенти без СПИН: ренални, сърдечни трансплантации, продължително лечение с кортикостероиди, левкемия; дисеминирани форми при имуносупресирани пациенти със СПИН 6,7,8,9.
Най-честа проява на микобактериоза са белодробните заболявания6,7. Поставянето на диагнозата е комплексна, включваща редица клинични, рентгенови и микробиологични критерии, представени от American Thoracic Society, както следва:
Клинични критерии: наличие на комбинация от симптоми на белодробно заболяване – кашлица, отпадналост, температура, загуба на телесна маса, задух.
Рентгенологични критерии: данни от Rö-графия или КАТ на бял дроб за наличие на персистиращи или прогресиращи нодуларни инфилтрати, обикновено с кавитации.
Микробиологични критерии:
- В рамките на една година от изследвани храчки/БАЛ пациента трябва да има поне:
а) 3 позитивни култури с отрицателно микроскопско изследване за киселинно устойчиви бактерии (КУБ)
б) 2 позитивни култури с положително микроскопско изследване за КУБ
- При наличност само на един БАЛ (при невъзможност за даване на храчка):
а) една позитивна култура с растеж (2+)
б) една позитивна култура, независимо от степента на растежа, но с поне (2+) положително микроскопско изследване
- Тъканна биопсия с:
а) една положителна култура, независимо от степента на растежа
б) специфични микобактерийни хистопатологогични белези (гранулом) или микроскопско изследване, положително за КУБ
в) включително всеки растеж от нормално стерилна екстрапулмонарна част, ако са налице клинични и рентгенови критерии за пулмонална инфекция
Началото на видовата идентификация на NTM в България, на базата на биохимични методи, е поставено през 70- те и 80- те години на 20 век в микробиологичната лаборатория към Националния институт по белодробни болести, като по-късно това е преустановено11. В периода 2001г. – 2005г. генотипна видова идентификация на NTM се е осъществявала в НРЛ по молекулярна микробиология, НЦЗПБ. След основаването на Националната Референтна лаборатория по туберкулоза към Национален център по заразни и паразитни болести (НРЛ ТБ, НЦЗПБ) през 2005 г., тази лаборатория осъществява диагностиката на NTM, използвайки комбинация от класически и модерни микробиологични методи.
Цел
Цел на настоящото проучване е да бъдат представени видовете нетуберкулозни микобактерии (NTM), изолирани от респираторни клинични материали на пациенти от цялата страна, за петгодишния период от 2007 до 2011г., в НРЛ по туберкулоза, НЦЗПБ.
Материали и методи
Настоящото проучване обхваща изолати от респираторни материали на пациенти, изследвани в микробиологичните лаборатории по туберкулоза към лечебните заведения в цялата страна, както и в НРЛ ТБ. Тези щамове са изпратени от съответните микробиологични лаборатории в НРЛ ТБ с цел идентификация.
Определените като NTM 127 щама са изолирани от следните респираторни клинични материали: храчка, БАЛ и стомашни промивни води (при деца). За културелна диагностика са използвани твърди и/или течни хранителни среди (Льовенщайн-Йенсен и/ или MGIT), съгласно съответните стандартни оперативни процедури, регламентирани в национални и международни ръководства12,13.
Основните методи, използвани за видова идентификация на всички NTM в НРЛ ТБ, са: микроскопски препарат за КУБ по Ziehl-Neelsen, субкултивиране на Льовенщайн-Йенсен и MGIT (Bactec MGIT 960 System – автоматизирана система), с последващо определяне на колониална морфология, фотореактивност (пигментообразуване), температурна зависимост и бързина на растежа; чувствителност/резистентност към пара-нитробензоена киселина, наличие/отсъствие на МРТ64 антиген чрез имунохроматографски тест BD MGIT TBc Identification Test. Идентификацията до вид се осъществи чрез молекулярно генетичните тестове Geno Type® Mycobacterium CM и AS (PCR тестове, известни като LPA, базирани на ДНК стрип технология) 15,16,17. Тези PCR тестове са комерсиални тестове, разработени за идентификация на най-разпространените и имащи отношение към човешката патология NTM. След ДНК изолация от чиста култура, с последваща амплификация на ген 23S рРНК и обратна хибридизация към специфични олигонуклеотиди, имобилизирани на мембранен стрип, се визуализира и отчита крайния продукт. Geno Type® Mycobacterium CM и Geno Type® Mycobacterium AS могат да се извършват независимо един от друг и взаимно се допълват.
GenoType® Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) позволява едновременната идентификация на M. tuberculosis complex и следните най-често срещани NTM: M. kansasii, M. xenopi, M. gordonaе, M. marinum/M. ulcerans, M. avium, M. intracelulare, M. scrofulaceum, M. malmoense, M. chelonae, M. fortuitum, M. abscessus, M. interjectum, M. peregrinum.
Geno Type® Mycobacterium AS (Additional Species) позволява независима идентификация на допълнителни видове NTM, имащи отношение към човешката патология: M. genavense, M. simiae, M. ulcerans, M. celatum, M. haemophilum, M. smegmatis, M. mucogenicum, M. goodii, M. lentiflavum, M. heckeshomense, M. szulgai, M. flei, M. gastrii, M. asiatikum,M. shimoidei.
Резултати
За периода на микробиологичното проучване в НРЛ ТБ се забелязва постепенно увеличаване на изолираните NTM щамове, както следва: през 2007 – 10 щама; 2008 – 7 щама; 2009 – 24 щама; 2010 – 34 щама и 2011г – 52 щама.
Преобладаващия брой NTM са изолирани от храчки – 84,25% (107), стомашни промивни води – 8,66% (11) и 7,09% (9) от БАЛ.
Едва 11,81% (15) от изследваните респираторни материали са били положителни и на директно микроскопско изследване по Ziehl-Neelsen за КУБ, като останалите 88,19% (112) са били отрицателни.
Разпределението по пол на пациентите, от чиито респираторни материали са били изолирани NTM, е в съотношение 1,6:1 в полза на мъжете, като те са 61,42% (78), а на жените – 38,58% (49).
Възрастовата структура на пациентите, от чиито респираторни материали са изолирани NTM, е представена на Фигура 1. Преобладават възрастовите групи над 55г., като 46,46% (59) от NTM щамове на пациенти са в категорията от 55 до 64 г., и тази над 64 г.
Фигура 1: Възрастова структура на пациентите с изолирани NTM щамове в периода 2007 – 2011г.
Установената видова структура на NTM, изолирани от респираторни материали през проучвания пет годишния период в България, е твърде разнообразна (Фигура 2). Най-често срещани са представителите на M. gordonae и M. fortuitum.
Фигура 2: Разпределение по видове на NTM, идентифицирани в НРЛ ТБ в периода 2007 – 2011г.
Представената видова структура на Фигура 2, може да бъде охарактеризирана накратко по литературните данни по следния начин:
Бавно растящи NTM
M.avium complex (МАС) включва видовете M.avium и M. intracellulare, които не могат да бъдат отдиференцирани с традиционните физични и биохимични тестове, а това се осъществява чрез специфични ДНК сонди. MAC се откриват в околната среда: вода, почва, растения, животни, водни системи, басейни. M.avium е по-важен като патоген при дисеминирани инфекции, а M. intracellulare е по-често срещан респираторен патоген6.
Изолираните МАС в България, представени в проучването, съставляват 7,08% и се нареждат на първо място след M. gordonae, M. fortuitum и M. lentiflavum.
Тестът GenoType® Mycobacterium CM дава възможността МАС да бъдат идентифицирани до вид и от изолираните 9 щама: 2 са били M.avium, а останалите 7 са били M. intracellulare. Един от изолатите е бил на пациент с диагноза муковисцидоза, а останалите 8 са били с клинична картина, суспектна за белодробна туберкулоза.
M. kansasii е вторият по честота в глобален мащаб причинител на NTM респираторни заболявания след MAC. Изолира се често от чешмяна вода. Обичайна находка е при миньори в Англия и Южна Африка. Най-честата манифестация на хроничната белодробна инфекция наподобява клиничната картина на класическата туберкулоза. Извънбелодробни локализации на инфекцията са редки, като цервикален лимфаденит при деца, кожни и мекотъканни инфекции6,14.
Изолираните М. kansasii в България, представени в проучването, съставляват 3,9%. Диагнозата на един от пациентите е била ревматоиден артрит, боледувал в миналото от туберкулоза, а останалите 4 са били с клинична картина, суспектна за белодробна туберкулоза.
M. gordonae често се изолира от клинични материали, но рядко се свързва с инфекция.
Той е най-често изолирания „непатогенен” вид в микобактериологичните лаборатории навсякъде по света. Широко разпространен в почва и води. Убедително доказателство за патогенността на този вид е трудно да бъде намерено6.
Идентифицираните като М.gordonae съставляват най-големия процент от всички изолирани NTM – 26% (33 щама). От пациентите 5 са били със съмнение за белодробна туберкулоза, 2 – с пневмония, 1 – с плеврит, 1 – с белодробен абсцес, 1 – с хроничен бронхит, 1 – на HIV положителен пациент, а 4 пациента са били от рисков контингент (Софийски затвор). За останалите пациенти липсват данни.
M. scrofulaceum е бил най-честият причинител на микобактериални цервикални лимфадениди при деца до 80-те години на миналия век, преди да бъде изместен от МАС. Други инфекции са рядкост – белодробни инфекции, конюнктивити, остеомиелити, менингити, грануломатозни хепатити6.
От NTM щамовете, включени в проучването, само един е идентифициран като M. scrofulaceum, при наркозависим пациент.
M. lentiflavum се изолира при лимфаденити, белодробни инфекции с кавитации, хронични белодробни болести, спондилодисцити, инфекции на кожа6.
От идентифицираните като M. lentiflavum 11 щама само един е на млад наркозависим пациент и е изолиран от храчка. Останалите 10 щама са изолирани от стомашни промивни води на деца, всички лежащо болни в едно и също лечебно заведение и отделение. В тези случаи M. lentiflavum е счетен като вероятен контаминант, попаднал от външната среда в хода на вземането на пробите.
Бързо растящи NTM
M. fortuitum group. Тази група обединява бързорастящи видове като М. fortuitum, M. peregrinum, M. porcinum, M. septicum, и др.
M. fortuitum предизвиква най-често посттравматични раневи инфекции, инфекции на оперативни рани, остеомиелит след отворени фрактури, инфекции, свързани със здравна грижа, и рядко причинява белодробни инфекции, предимно при хронична аспирационна болест6,18.
Изолираните М. fortuitum, включени в проучването, са вторият по честота вид след М.gordonae – 24,4% (31 щама), a M. peregrinum са идентифицирани в 4,7% (6 щама).
Тъй като изолатите от пациентите са единични, М. fortuitum трудно могат да бъдат определени като етиологичен агент на заболяването. В 23 от случаите, пациентите са били с хронично белодробно заболяване, 1 наркозависим и 2-ма затворници. За останалите пациенти не са посочени причините за микрибиологичното изследване.
М. abscessus е причинител на раневи инфекции, дисеминирани кожни инфекции, хронични белодробни инфекции, инфекции при пациенти с кистозна фиброза, кератити, възпаление на средното ухо (отитис медия) и инфекции, свързани със здравна грижа6,18.
В НРЛ ТБ са идентифицирани 2 щама М. abscessus, единият от които е бил положителен и на директна микроскопия. И двамата пациенти са били суспектни за белодробна туберкулоза.
M. chelonae е причинител на раневи инфекции, дисеминирани кожни инфекции при имуносупресирани пациенти, кератити, инфекции, свързани със здравна грижа и рядко причинява белодробни инфекции6,18.
В НРЛ ТБ са идентифицирани 5 щама M. chelonae от храчка, като за 3-ма от пациентите има сведения за хронично белодробно заболяване.
Таблица 2: Разпределение на NTM по области на местоживеене на па- циентите, от които са изолирани щамовете
Mycobacterium spp. – за петгодишния период на проучването 14,2% (18 щама) бяха идентифицирани само до род, изключвайки М. tuberculosis complex, поради лимитациите на комерсиалния тест. Според физичните и биохимичните тестове, към групата на бързо растящите NTM бяха отнесени 15 от тези изолати, а останалите 3 щама – в групата на хромогенните щамове.
При половината от пациентите не е посочена диагнозата и цел на изследването.
Идентифицираните в проучването 127 щама NTM са на пациенти от 21 области в страната, както и на лишени от свобода (в Софийския затвор). Териториалното им разпределение, представено в Таблица 2, отразява не толкова реалното им разпространение в България, колкото насоченото им търсене от клиницисти и микробиолози от съответните лечебни заведения.
Обсъждане:
За първи път в страната беше осъществено микробиологично проучване на NTM, изолирани в продължение на пет години, от респираторни материали на пациенти, чрез прилагането на съвременните PCR тестове, базирани на ДНК стрип технология Geno Type® Mycobacterium CM/AS, комбинирани с класическите физични и биохимични тестове.
Оценката на тези NTM, като етиологичен момент в диагнозата на белодробните микобактериози, е сложна и комплексна задача, изискваща много близко сътрудничество между клиницисти и микробиолози. Липсата на насоченост и активно търсене, както и недостатъчната информация при попълване на документацията, съпровождаща взетия материал за изследване, допълнително усложняват тази задача.
В близо половината от случаите (40,94%) не се съобщават причините за изследването или работната диагноза. В 13,38% от случаите има данни за принадлежност към рискова група (роми, наркозависими, затворници, имунна компрометираност). В 45,67% от случаите са насочени за изследване със съмнение за туберкулоза или при остри или хронични възпалителни процеси на белия дроб.
NTM продължават да бъдат предизвикателство пред клиницисти и микробиолози. Игнорирането на тези щамове, неглижирането им като непатогени/контаминанти, или оценяването им като клинично значими при еднократното им изолиране, са само част от проблемите в практиката. Всеки отделен случай трябва да бъде разглеждан и обсъждан много внимателно и подробно при добра колаборация между различните специалисти. Всички съмнителни или доказани NTM щамове трябва да бъдат изпращани в НРЛ TB за видова идентификация.
Заключение:
Целта на проучването беше представяне на видовете нетуберкулозни микобактерии (NTM), изолирани от респираторни клинични материали на пациенти от цялата страна. Микробиологичното проучване обхваща пет годишен период – от 2007 до 2011 г., и е осъществено е в НРЛ ТБ, НЦЗПБ. Чрез класическите физични и биохимични, и съвременните бързи и модерни имунохроматографски и молекулярно генетични тестове бяха идентифицирани 127 изолата NTM: 37 – M. fortuitum complex; 33 – M. gordonae; 18 - Mycobacterium spp; 11 – M. lentiflavum; 9 - M. avium complex; 6 – M. chelonae; 5 - M. kansasii; 2 - M. mucogenicum; 1 - M. scrofulaceum и 1 – M. celatum.
Част от направените изследвания бяха извършени благодарение на безвъзмездно предоставените консумативи, реактиви и тестове, по програми, финансирани от Глобалния Фонд за борба със СПИН, туберкулоза и малария: BUL-607-G02-T, BUL-809-G03-T.
Литература:
1. Garrity George M., J.Bell, T.Lilburn, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, 2003, 206-231
2. Brown-Elliott, B. A., Griffith, D. E. & Wallace, R. J., Jr, Newly described or emerging human species of nontuberculous mycobacteria. Infect Dis Clin North Am 16, 2002, 187–220
3. Tortoli, E., Impact of genotypic studies on mycobacterial taxonomy: the new mycobacteria of the 1990s, Clin Microbiol Rev 16, 2003, 319–354
4. Добрев П., Лечение на белодробните болести, Микобактериални инфекции, Медицина и физкултура,1999,163-167
5. V.M. Katoch,Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM), Indian J Med Res 120, October 2004, 290-304
6. American Thoracic Society Diagnosis, treatment and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2007, 175:367-416
7. Taiwo B, Glassroth J., Nontuberculous mycobacterial lung diseases, Infect Dis Clin North Am., 2010 Sep; 24:769-89.
8. King C. Harold, David A. Ashford, Karen M. Dobos et al., Emerging infection 5, chapter 9, Mycobacterium ulcerans Infection and Buruli Ulcer Disease, Emergence of a public Health Dilemma, 137-149
9. Coulter Chris, Skin and soft tissue infectious due to non-tuberculosis mycobacteria, Microbiology Australia, vol 25, number 4, 2004, 10-14
10. Bastian Ivan, Mycobacteriology in Australia in the 21 st centure, Microbiology Australia, vol 25, number 4, 2004, 4-9
11. Калфин Е., А. Енгибаров, Сборник инструктивни материали по микробиологична диагностика на бактериалните инфекции,1989, МНЗСГ,т.1, 118-126
12. Laboratory services in tuberculosis control, Culture, part III, WHO/TB/98.258
13. Методично указание за микробиологична диагностика и лечение на туберкулозата, МЗ, 2009
14. Falkinham,J.O., Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin. Microbiol.Rev.9; 1996, 178-215
15. Richter E, Rüsch-Gerdes S, Hillemann D, Evaluation of the GenoType Mycobacterium Assay for identification of mycobacterial species from cultures, J Clin Microbiol, 2006 May; 1769-75.
16. Z. Gitti, I. Neonakis, G. Fanti, et al., Use of the GenoType Mycobacterium CM and AS Assays To Analyze 76 Nontuberculous Mycobacterial Isolates from Greece, J Clin Microbiol. 2006 June; 2244–2246
17. Gaby E. Pfyffer, Frantiska Palicova, Mycobacterium: General Characteristics, Laboratory Detection, and Staining Procedures, Manual of Clinical Microbiology, ISBN 978-55581-463-2, 2011, vol.1, 472-495
18. Barbara A. Brown-Elliot, Richard J.Wallace, Jr Mycobacterium: Clinical and Laboratory Characteristics of Rapidly Growing Mycobacteria, Manual of Clinical Microbiology, ISBN 978-55581-463-2, 2011, vol.1, 525-535
Влезте или се регистрирайте безплатно, за да получите достъп до пълното съдържание и статиите на списанието в PDF формат.