Препоръки за диагноза и лечение на белодробен карцином
Савелина Поповска
Кореспонденция: проф. д-р Савелина Поповска, дмн, Катедра Патологоанатомия, Медицински Университет Плевен
Диагностиката и лечението в онкологията неминуемо водят до интегрирането на персонализираната медицина в ежедневната практика като за всеки отделен пациент се приема персонализиран подход. Персонализираната онкология се основава на фармакогеномиката и ефекта от генетичните различия между индивидите върху начина, по който пациентите понасят предписаната им терапия. Биомаркерите, валидирани с методите на молекулярната биология, позволяват разчитането на генетичните характеристики на раковите клетки и съответно индивидуализиране на лечението. Биомаркерите могат да бъдат разделени на две основни подгрупи: прогностични и предиктивни. Целта на прилагането на прогностичните биомаркери е да се улесни диагностиката на онкологичното заболяване. Предиктивните биомаркери помагат да се оптимизират решенията за терапия, тъй като те предоставят информация за вероятността за отговор на дадено лечение. Сред прогностичните фактори, които идентифицират пациентите с различен риск (напр. рецидив на заболяването), могат да се разграничат следните фактори: соматични и герминативни мутации, промени в метилирането на ДНК, които водят до засилване или потискане на генната експресия, появата на повишени нива на микроРНК (miRNA), способни да свързват специфични молекули на РНК (мРНК), което влияе на генната експресия, както и наличието на циркулиращи туморни клетки (цТК) в кръвта, което дефинира по-лоша прогноза за пациента. Биомаркерите в персонализираната онкология се използват както в хематологията, така и в онкологията, главно в молекулярната диагностика на хронична миелоидна левкемия, рака на дебелото черво, гърдата и белия дроб, както и при меланом. Те се прилагат успешно за оценка на ползите, които могат да бъдат постигнати чрез целенасочена терапия или при оценката на токсичните ефекти на химиотерапевтичните средства, използвани в терапията.
MSI/MMR
Някои екзогенни агенти увреждат ДНК, променяйки химичната ù структура и потискайки активността на ДНК-полимеразата. Мутациите могат да възникнат и спонтанно чрез деаминиране на бази или увреди от активни кислородни радикали, нарушаващи целостта на ДНК. Съществуват различни механизми за възстановяване на ДНК-увреди, настъпили в резултат от грешки на репликация или външни въздействия. Малка част от ДНК-мутациите се дължат на грешки при репликация. В основата на точността на този процес стои специфичното сдвояване на нуклеотидни бази чрез ДНК-полимераза и корекция на погрешно инкорпорирани бази. Точността е опосредствана от специализирани белтъци и пострепликационен контрол, извършвани чрез механизъм за възстановяване на несъответствията в ДНК (DNA mismatchrepair-MMR). Репликацията на увредена ДНК се извършва чрез „избягване” на увредените участъци (damage avoidance) или чрез транслезионен синтез (translesion synthesis – TLS). Процесът на „избягване” на увредените участъци има за цел да осигури репликация от повреден шаблон, като същевременно полимеразата избягва репликация на увредени участъци и извършва пострепликационно рекомбинантно възстановяване или прекъсване на увредените ДНК-вериги с последващо възстановяване на ДНК. Транслезионният синтез изисква полимеразата да „прочете“ повредените бази за сметка на репликационната точност, като често този механизъм стои в основата на репликационни грешки1.
Механизми за възстановяване на ДНК
Поддържането на генетичната стабилност на клетката изисква едновременното действие на няколко различни механизма на възстановяване на увредената ДНК:
Възстановяване с изрязване на бази (BER);
Възстановяване на несъответствията в ДНК (DNA mismatchrepair, MMR). Системата за поправка на неправилно сдвоени бази на ДНК (MMR) е механизъм за възстановяване на ДНК-последователността след настъпване на грешки при ДНК-репликация, рекомбинация или ятрогенни увреди2,3.
Този процес подобрява точността на ДНК-синтезата 100-1000 пъти и допълва репаративните свойства на репликативните ДНК-полимерази, намалявайки общата мутационна честота до една грешка на 1010 синтезирани нуклеотиди. В процеса на коригиране на несъответстваща ДНК участват и различни MMR протеини: MLH1, PMS2, MSH2, MSH6, MLH3,MSH3, PMS1 и Exo14. Системата на MMR участва и в регулация на клетъчното делене и р53-зависимия апоптотичен отговор на различни ДНК-увреждания. Дефицитът на MMR (dMMR) води до невъзможност за елиминиране на увредени клетки, а дефектите в механизма на MMR рефлектират в увеличаване на мутационната честота (мутантен фенотип) и участват в патогенезата на наследствен и спорадичен карцином с различна локализация – колоректален, карциноми на ендометриум, яйчници, карциноми на ГИТ, уротелни карциноми и др. Биалелното инактивиране на един от гените, кодиращи белтъците за регулация на MMR-механизма (поради соматична или герминативна мутация или епигенетично потискане на експресията им) водят до дефицит в MMR-системата за възстановяване (dMMR), свързан с повишено натрупване на мутации в генома на клетките5.
Микросателити и микросателитна нестабилност (MSI)
Микросателитите са къси повторени ДНК-последователности с дължина, варираща от 1 до 6 бази, които се срещат като би- или мононуклеотиди (~3% от генома) както в кодиращи, така и в некодиращи региони. Те са високо полиморфни в популацията, но стабилни в рамките на индивида6. Поради своя състав от повтарящи се бази и широко разпространение тези ДНК-секвенции са особено чувствителни на грешки поради неправилно сдвояване на бази. Дефицитът на MMR системата (dMMR) води до промяна в дължината на микросателитите, което се приема като мутации и се използват като белег на възможността на системата да възстановява ДНК 7,8.
Тумори с MSI в следствие на dMMR могат да се проявят с високо нестабилен MSI-H (high) фенотип, който се характеризира с множество мутации и от своя страна, стимулира имунната система9,10. Микросателитните маркери показват генетична нестабилност (MSI), която може на се дължи на герминативна или соматична инактивация на MMR-гените. Морфологично MSI-H-туморите съдържат високи нива на лимфоцитни инфилтрати и експресия на имунни чекпойнт-протеини PD-1 и PD-L1. По правило dMMR/MSI- H се среща при редица карциноми в стадии I-IV.
С метода на имунохистохимията (ИХХ) се изследва ядрена експресия на четири ММR-протеина. По правило ИХХ-изследване се извършва на материали от фиксирани в 10% буфериран формалин и включени в парафин тъкани от карцином. ИХХ-метод за доказване на експресия на MMR-протеини се използва паралелно с MSI PCR-изследване или самостоятелно с валидирани китове и участие във външен контрол. Молекулярните изследвания се извършват върху ДНК, изолирана от свежа, замразена или включена в парафин туморна тъкан с използване на PCR-базиран тест за откриване на MSI.
Pembrolizumab например е одобрен от Американската агенция за храни и лекарства (FDA) за лечение на възрастни и деца с нерезектабилни или метастатични (MSI-H) или dMMR-солидни тумори, прогресирали след предходно лечение и нямащи задоволителна терапевтична алтернатива.
PD-L1
PD-1 регулира клетъчното активиране и се приема за контролна точка (чекпойнт) в Т-лимфоцит-опосредстваната антитуморна атака. PD-1 е експресиран върху повърхността на Т-лимфоцити, В-лимфоцити и моноцити. PD-L1 и PD-L2 са лиганди за PD-1 и се откриват, освен при туморни, върху клетъчни мембрани в нормални тъкани като сърце, бял дроб и плацента. Свързването на PD-1 към PD-L1 или PD-L2 инхибира Т-клетъчното активиране и потиска вече активираните Т-клетки като блокира позитивните сигнали за антиген представянето. Експресията на PD-L1 от туморни клетки е може би основен механизъм, чрез който те блокират имунната система, поради което PD-1/PD-L1 чекпойнт инхибиторите се използват като своеобразна спирачка” за този механизъм и съответно активиране на имуномедиирания отговор към тумора11.
Изследването на мембранно експресирана структура върху биопсичен материал се извършва чрез имунохистохимия (ИХХ), като се използват различни моноклонални антитела. Позитивността варира за положително оцветяване от > 1% до > 50% от туморните клетки, като се прилагат различни методики на оценка. При НДРБД се използва процент на жизнеспособни туморни клетки с частично или пълно мембранно оцветяване за маркера (TPS). При стомашен аденокарцином например се прилага комбинирана оценка CPS: брой на PD-L1–позитивни клетки (туморни клетки, лимфоцити, макрофаги) разделен на общия брой жизнеспособни туморни клетки.
Ролята на този маркер не е категорична при всички тумори. Въпреки че позитивност за PD-L1 предполага клинична полза от чекпойнт инхибитори, PD-L1 негативен резултат не изключва автоматично потенциални ползи от такава терапия. Поради тази причина, макар и предпочитан, PD-L1 не е универсален, нито пък единствен маркер за предсказване на отговор и селекция на пациенти за имунотерапия.
Редица медикаменти (имунотерапия) са одобрени за лечението на солидни тумори: Pembrolizumab, Atezolizumab, nivolumab, durvalumab, avelumab и др.
EGFR-активиращи мутации
Мутациите в EGFR гена са онкогенни драйвъри в недребноклетъчния белодробен карцином (НДРБД). Определени активиращи EGFR мутации, като делеция в екзон 19 и точкова мутация в екзон 21 L858R, са с предиктивна стойност за чувствителност към EGFR TKИ. Двете заедно отговарят за около 85% от EGFR-мутациите при НДРБД (т. нар. чести мутации). Откриват се в 15% до 40% от пациентите с НДРБД, най-често при жени и непушачи, азиатски произход. Най-често се срещат при азиатска раса – 38.8%; в европеидната – 17.4%; при тъмнокожи – 17.2%; превалират при жени – 43.7%; мъже – 24.0%. Най-често се среща при хистология за аденокарцином в 38.0%, но и при други хистологии – 11.7%.
Най-често при непушачи – 49.3%; по-рядко при пушачи – 21.5% По правило EGFR-мутациите са хетерогенни. Мутациите в EGFR-гена водят до конститутивно активиране на сигнални пътища, критични за туморен растеж. Има много места в EGFR-гена, където могат да се случат активиращи мутации и те се асоциират с различна чувствителност към EGFR-инхибиране.
Активиращи EGFR-мутации са предиктивни за отговор към EGFR тирозинкиназни инхибитори (ТКИи) от първа (gefitinib, erlotinib), втора (afatinib) и трета (osimertinib) генерация ТКИ. Редица рандомизирани проучвания са доказали подобрение в свободната от прогресия и обща преживяемост, с което на практика ТКИ са наложени като стандарт за първа линия на лечение спрямо стандартните химиотерапевтични режими при пациенти с авансирал и метастатичен НДРБД, чиито тумори експресират активиращи мутации. Различните EGFR-мутации са представени в таблица 1.
EGFR T790M-мутация за резистентност
В рамките на 9-12 месеца (средно 10) повечето пациенти с недребноклетъчен белодробен карцином (НДРБД) прогресират в хода на терапията с ТКИ. Съществуват различни механизми на придобита резистентност към първа генерация EGFR-ТКИ, като в две трети от случаите (50-60%) се касае за поява на единична миссенс-мутация в екзон 20, обозначавана като T790M-мутация или мутация за резистентност12,13. Тя води до субституция на треонин с метионин на позиция 790, който кодира част от киназния домейн на рецептора. Последва увеличен афинитет към АТФ и резистентност към инхибирането от обратими EGFR-ТКИ, като тези от първа генерация – gefitinib и erlotinib114,15. ТКИ от трета генерация е доказал своя ефект при пациенти в първа линия на лечение, както и след прогресия на фона на терапия с друг ТКИ, след доказване на мутацията за резистентност.
RAS-мутации
Гените KRAS и NRAS са тясно свързани членове на RAS-онкогенното семейство. Промени в екзони 2, 3 и 4 при всеки ген конститутивно активират RAS и са взаимно изключващи се. Досега няколко ретроспективни анализа от рандомизирани клинични проучвания валидират пан-RAS-мутациите като негативни предиктивни фактори за анти-EGFR-терапия16.
Невробластома-RAS (NRAS)-генът принадлежи към RAS-онкогенното семейство и е локализиран на 1 хромозома. Кодира GTP-аза-мембранен протеин, който функционира като молекулярен превключвател между клетъчната мембрана и системата на Golgi. Вирусният онкогенен хомолог на саркома на Kirsten при плъх (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS) принадлежи към семейството на RAS-онкогените, заедно с HRAS и NRAS. Генът KRAS кодира GTP-свързващ протеин. По правило KRAS действа низходящо от няколко тирозинкиназни рецептора, вкл. EGFR, и е свързан с активирането на RAS/RAF/MAP-киназа (MEK/ERK) и RAS/MAPK- сигнални пътища17.
За детекция на RAS-мутации могат да се използват различни методи, като PCR и NGS.
Мутации в KRAS има в 25% до 35% от пациентите с недребноклетъчен белодробен карцином, най-често при аденокарциноми. Известно е, че KRAS-мутациите са по-силно асоциирани с тютюнопушене, отколкото повечето други активиращи онкогенни мутации, описани при НДРБД. Идентифицирани са KRAS-мутации при 34% пушачи и 6% непушачи с белодробен аденокарцином.
Наличието на KRAS-мутация може да се асоциира с лоша прогноза при НДРБД и да е негативен предиктор за отговор към химиотерапия. Допълнително е свързана с увеличена вероятност от наличие на втори първичен тумор и при НДРБД е предиктивен маркер за резистентност към таргетна терапия с EGFR тирозинкиназни инхибитори (ТКИи) като gefitinib или erlotinib. KRAS‑, EGFR- и ALK-мутациите се считат за взаимно изключващи се.
ALK-пренареждания
Киназата на анапластичния лимфом (ALK) е трансмембранен тирозинкиназен (TK) рецептор. Идентифициран е за първи път като фузионен партньор на нуклеофозмин при анапластичен едроклетъчен лимфом, от където идва абревиатурата му. Притежава вътреклетъчен домейн, който е въвлечен в сигналните пътища RAS/RAF/MAPK, PI3K/AKT и JAK-STAT. Рецепторът се кодира от ALK-ген, намиращ се в късото рамо на хромозома 2 (2p23). Около 3-7% от пациентите с недребноклетъчен белодробен карцином се диагностицират с фузии на ALK18. Най-чест фузионен партньор е EML4, което води до малка инверсия на късото рамо на хромозома 2. ALK-пренарежданията са свързани с определени клинични характеристики (непушачи или леки пушачи и по-млада възраст) и хистологични характеристики (аденокарцином, муцинозна морфология или морфология пръстен с камък) 19. ALK-пренарежданията са взаимоизключващи се с други онкогенни активиращи мутации. Карциноми с ALK-пренареждания са зависими от непрекъсната сигнализация чрез фузионния протеин, поради което са високо чувствителни към таргетна терапия.
Препоръчително е всички белодробни аденокарциноми да бъдат тествани за наличие на ALK-пренареждания. Тестване трябва да се извършва от патолог, биолог и лаборант с необходимо обучение за изследване на солидни тумори чрез FISH. Докладвана е висока чувствителност и специфичност на имунохистохимия (ИХХ) за ALK-пренареждания20. Разработени са и поредица от иновативни подходи, базирани на секвениране от ново поколение (NGS) за намиране на генни фузии между много таргетни гени.
ALK-позитивният НДРБД показва различна преживяемост без прогресия (ПБП), което най-често е следствие от развиваща се резистентност към crizotinib (ALK-инхибитор от първа генерация) за период от 1-2 години. Подобно на EGFR, прогресия може да се причини от резистентни мутации в TK-домейн на ALK, най-често L1196M-мутация. рандомизирани проспективни проучвания доказват клиничната ефективност на втора генерация ALK-инхибитори ceritinib24 и alectinib25 при рецидивиращ ALK-позитивен НДРБД. Доказателствата за клиничната ефективност на alectinibго препоръчват като медикамент на избор за първа линия21.
ROS1-пренареждания
ROS1 принадлежи към семейството на човешката рецепторна тирозинкиназа и е еволюционно близка до семейството на ALK, което е част от научната обосновка за използване на ALK-инхибитори като инхибитори на ROS1. Генът ROS1 се намира в хромозома 6 (6q22) и кодира транс-мембранен протеинов рецептор. Екстрацелуларният му N-терминален участък съдържа повече от 1800 аминокиселини, което го превръща в един от най-големите извънклетъчни домейни сред всички човешки TKРи. Въпреки това, досега не е известен нито един ROS1-лиганд при хора и физиологичната функция на този рецептор е все още неясна. С-терминалната част на ROS1 съдържа киназен и трансмембранен домейн. Геномни пренареждания, включващи ROS1, се срещат в 1-2% от недребноклетъчния белодробен карцином. Известни ROS1-фузионни партньори при НДРБД са FIG, CD74, SLC34A2 и SDC4, като този списък се увеличава. CD74-ROS1 е най-често откривана ROS1-фузия22.
Когато се тества ROS1, е препоръчително да се тества същият туморен материал, избран за тестване на EGFR и ALK. Идеалният вариант е това да става паралелно при налична тъкан от първата серия срезове. Традиционният подход за намиране на ROS1-генни пренареждания е чрез двуцветна „break apart” флуоресцентна in situ хибридизация (FISH). Имунохистохимията (ИХХ) е ефективен скринингов метод за намиране на ROS1-позитивeн НДРБД с чувствителност 100% и променлива специфичност 92-100% според границата, използвана за определяне на позитивност. Тестването за ROS1 често се осъществява на втори етап при пациенти, негативни за EGFR, ALK и KRAS, които никога не са пушили или са дългосрочно непушещи бивши пушачи.
Инхибиране на ROS1 с crizotinib е проучвано в редица клинични изпитвания в ранна фаза при пациенти с авансирал ROS1-положителен НДРБД.
HER2-мутации
HER2 (ERBB2) е рецептор на тирозинкиназа от фамилията на EGFR. Мутациите са по типа на in-frame инсерции или точкови мутации в екзон 20. Тези тумори са обикновено аденокарциноми при непушачи и при жени. Мутации в HER2 се намират при 1-2% от НДРБД. Поредица от клинични случаи предполагат, че тумори с HER2-инсерции често отговарят на trastuzumab плюс химиотерапия или на afatinib (EGFR/HER2 ТКИи).
МЕТ-аберации
MET е тирозинкиназен рецептор за хепатоцит-растежния фактор (HGF). Аберациите включват MET-екзон 14 skipping мутация (при 3% от белодробните аденокарциноми и до 20% от белодробните карциноми тип саркоматиден вариант), MET-генна амплификация (при 2-4% при нелекуван НДРБД) и MET с EGFR-комутации (при 5-20% от EGFR- мутиралите тумори, които са придобили резистентност към EGFR-инхибитори)23. Проучвана е поредица от инхибитори с активност срещу MET за три аномалии. Първата е MET-екзон 14 skipping мутация, която намалява разграждането на MET-протеина, правейки го онкогенен драйвер. Crizotinib е мощен MET-инхибитор, освен че инхибира ALK и ROS1. Втората аномалия е MET-амплификация. Повишена експресия на MET може да предскаже отговор към MET-таргетни лекарства, но също изглежда да е свързана като цяло с по-лоша прогноза. Трета аномалия е MET при налични EGFR-мутации. Поради това, че MET-амплификацията може да допринесе за придобита резистентност към EGFR ТКИи, комбинирането им с MET-инхибитори е в клинични проучвания.
RET- транслокации
По правило RET-генът кодира тирозинкиназен рецептор на клетъчната повърхност, който често е променен при медуларен карцином на щитовидна жлеза. Повтарящи се транслокации между RET и различни фузионни партньори (CCDC6, KIF5B, NCOA4) са идентифицирани при 1-2% от аденокарциномите и се намират по-често при млади пациенти и непушачи24.
Мутации в BRAF и HER2 при пациенти с НДРБД са установени чрез PCR или секвениране от ново поколение (NGS). RET-транслокациите могат да се установят с break-apart FISH или NGS. По-голяма част от тези геномни алтерации могат да се търсят в туморна тъкан и чрез течна биопсия в циркулираща туморна ДНК (ctDNA), когато няма тъкан за изследване или за да се търсят механизми на придобита първична или вторична резистентност.
Циркулиращи туморни клетки
Циркулиращите туморни клетки (цТК) са такива, които са се освободили от първичното туморно ложе и са навлезли в кръвното или лимфатично русло. Разработени са няколко метода за откриване и оценка на количеството на цТК при болни с неопластични заболявания. Молекулярният анализ на цТК или т.нар. течна биопсия преди лечение на онкологично заболяване дава възможност за нейното оптимизиране и персонализиране. цТК представляват хетерогенна популация, в това число и резистентни на системна терапия туморни клетки, които могат да метастазират. Независимо от ниския им брой в периферията, нивото на цТК по време на лечение се оказва ранен прогностичен маркер за терапевтичен отговор25.
Послание за практиката
В ерата на прецизната медицина именно предиктивните маркери са крайъгълният камък на категоричната промяна в парадигмите за лечението на белодробния карцином, нов подход в диагностиката и лечението, чиято цел е индивидуализирането на терапията на база генетичните характеристика на тумора.
Литература:
1. Shilpa V, Lakshmi K. Molecular mechanisms of mismatch repair genes in cancer – A brief review. J Proteomics Genomics 2014; 1 (1): 101
2. Sinicrope FA, Rego RL, Foster N, et al. Microsatellite instability accounts for tumor site-related dif- ferences in clinicopathologic variables and prognosis in human colon cancers. Am J Gastroenterol 2006; 101 (12): 2818-2825
3. Jass JR. Classification of colorectal cancer based on correlation of clinical, morphological and mo- lecular features. Histopathology 2007; 50 (1): 113-130
4. Chen W, Swanson BJ, Frankel WL. Molecular genetics of microsatellite-unstable colorectal cancer for pathologists. DiagnPathol [Internet] 2017; 12 (1). Available at: http://diagnosticpathology.bi- omedcentral.com/articles/10.1186 s13000-017-0613-8
5. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 1990; 61 (5): 759-767
6. Thibodeau SN, French AJ, Cunningham JM, et al. Microsatellite instability in colorectal cancer: differ-entmutator phenotypes and the principal involvement of hMLH1. Cancer Res 1998; 58 (8): 1713-1718
7. Boland CR, Goel A. Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology 2010; 138 (6): 2073-2087.e3
8. Li SKH, Martin A. Mismatch repair and colon cancer: Mechanisms and therapies explored. Trends Mol Med 201; 22 (4): 274-289
9. Le DT, Uram JN, Wang H, et al. PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency. N Engl J Med 2015; 372 (26): 2509-2520
10. Dudley JC, Lin M-T, Le DT, Eshleman JR. Microsatellite Instability as a Biomarker for PD-1 Block- ade. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 2016; 22 (4): 813-820
11. Leach DR, MF Krummel, JP Allison.Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science 1996; 271 (5256): 1734-1736
12. Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res 2013; 19: 2240-2247
13. Blakely CM, Bivona TG. Resiliency of lung cancers to EGFR inhibitor treatment unveiled, offering opportunities to divide and conquer EGFR inhibitor resistance. Cancer Discov 2012; 2: 872-875
14. Pao W, Miller VA, Politi KA et al. Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlo- tinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. PLoS Med 2005; 2: e73
15. Yun CH, Mengwasser KE, Toms AV et al. The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinity for ATP. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105: 2070-2075
16. Stella GM, Scabini R, Inghilleri S, et al. EGFR and KRAS mutational profiling in fresh non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. J Cancer Res Clin Oncol 2013; 139 (8): 1327-1335
17. Kempf E, Rousseau B, Besse B, et al. KRAS oncogene in lung cancer: focus on molecularly driven clinical trials. Eur Respir Rev 2016; 25 (139): 71-76
18. Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature 2007; 448: 561-566
19. Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non- small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol 2009; 27: 424753
20. Wynes MW, Sholl LM, Dietel M, et al. An international interpretation study using the ALK IHC antibody D5F3 and a sensitive detection kit demonstrates high concordance between ALK IHC and ALK FISH and between evaluators. J Thorac Oncol 2014; 9: 6318
21. Shaw AT, Peters S, Mok T, et al. Alectinib versus crizotinib in treatment-naive advanced ALK posi- tive non-small cell lung cancer (NSCLC): Primary results of the global phase III ALEX study. J Clin Oncol 2017; 35 (Suppl; Abstr. LBA9008)
22. Rimkunas VM, Crosby KE, Li D, et al. Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion. Clin Cancer Res 2012; 18 (16): 4449- 4457
23. Awad MM, Oxnard GR, Jackman DM, et al. MET exon 14 mutations in non-small-cell lung cancer are associated with advanced age and stage-dependent MET genomic amplification and c-Met over- expression. J Clin Oncol 2016; 34: 721
24. Wang R, Hu H, Pan Y, et al. RET fusions define a unique molecular and clinicopathologic subtype of non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol 2012; 30: 4352
25. Mitra A, Mishra L, Li S. EMT, CTCs and CSCs in tumor relapse and drug-resistance. Onco-target 2015; 6: 10697-10711