Поведение при инфекции на горни и долни дихателни пътища в детска възраст.
Резюме
Легионерската болест (ЛБ) често е тежка, животозастрашаваща атипична пневмония. Въпреки че в много от случаите тя остава недиагностицирана, по данни на Европейската надзорна мрежа за ЛБ през 2018 г. страните членки са докладвали над 11 000 болни с леталитет към момента на нотифициране ~ 8% (при проследяване на изхода, леталитетът винаги е по-висок!). Заболяването все още се подценява у нас. Това се случва както в личностно-здравен, така и в обществено-здравен и социално-икономически аспект.
В настоящият материал се фокусираме върху резултатите от легионела-насочени изследвания при 30 пациенти с ЛБ в България (и двама с неуточнен легионелен статус).
Откриването на легионелен антиген в урина е водещ метод за бързо и точно доказване на потвърдена ЛБ и при български пациенти с пневмония (~87%). Макар и трудно, изолирането на легионели е възможно при навреме изпратени клинични материали и остава „златен стандарт“ в диагностиката на ЛБ. Успеваемостта на това изследване в нашето проучване бе в ~ 55% от получените за култивиране проби. При двама пациенти това бе единственият положителен резултат, определящ категорията на легионелната инфекция като „потвърден случай“.
Изследване на единична серумна проба чрез директна имуно-флуоресценция и PCR не се препоръчват като самостоятелни тестове за легионелна етиология поради често грешното интерпретиране както на негативни, така и на позитивни резултати. Въпреки това, при наличие на експертна оценка, те имат своята ориентировъчна и инициираща по-задълбочени проучвания стойност.
От основно значение за коректната диагностика на ЛБ са навременното изпращане на пул от проби (урина, материал от долни дихателни пътища, серум) и ЛБ-насочени анамнестични данни.
Тази комбинация дава възможност, според индвидуалните характеристики на случая, в микробиологичната лаборатория да се подберат оптималните варианти на изследвания за доказване етиологичната роля на бактериите от род Legionella .
Ключови думи: атипична пневмония, Легионерска болест, легионелен антиген в урина, микробиологична диагностика.
Diagnosis of Legionnaires’ disease in Bulgarian patients
I. Tomova1, R. Nenova1, N. Brankova2, V. Levterova2
1National Reference Laboratory “Special Bacterial Pathogens”, 2National Reference Laboratory “Molecular biology” – National Center of Infectious and Parasitic Diseases – Sofia, Bulgaria
Correspondence: Assist. Prof. Iskra Tomova, MD, PhD, NRL Special Bacterial Pathogens, NCIPD, 44 A General Stoletov Blvd., 1233 Sofia, Bulgaria
e-mail: iskra.tomova@gmail.com
Legionnaires’ disease (LD) is often a severe, life-threatening atypical pneumonia. Although in many cases it remains undiagnosed, according to the European Legionnaires’ disease Network in 2018 EU/EEA members reported more than 11,000 patients with a mortality rate at the time of notification ~ 8% (at the outcome stage this rate is always higher!). The disease is still underestimated in Bulgaria. This happens in personal health, public health and socio-economic aspects.
Herein, we will focus on the results of Legionella-targeted tests in 30 patients with LD diagnosed in Bulgaria (and two with unspecified legionella status).
The detection of Legionella antigen in urine is the leading method for rapid and accurate detection of confirmed LD in the tested Bulgarian patients with pneumonia (~ 87%). Cultivation remains the “gold standard” in LD diagnosis. Although difficult, isolation of Legionella is possible when appropriate clinical samples are submitted, with a success rate of ~ 55% from the materials sent for this purpose in our study. In two patients, this was the only positive result that defined the pneumonia as a confirmed LD. Single serum sample or direct immunfluorescence and PCR are not recommended as stand-alone tests for legionella etiology because of the often misinterpretation of both negative or positive results. However, in the presence of expert review, they have their quick orientating value and are reason for further investigations.
Timely sending of a pool of samples (urine, lower respiratory tract material, serum) and LD-targeted anamnesis data are of key importance for correct LD diagnosis. This combination makes possible the selection of optimal test variants according to the individual case characteristics, in order to demonstrate the etiological role of Legionella bacteria.
Key words: atypical pneumonia, Legionnaires’ disease, Legionella urine antigen, microbiological diagnosis.
Използвани съкращения:
Abindex - антитяло индекс
BCYEa – буфериран въглищно-дрождев екстракт агар с растежни суплементи
ДДП – долни дихателни пътища
ДИФ – директна имунофлуоресценция
ELISA – ензимно свързан имуносорбентен анализ
ICT – имунохроматографски тест
Ig - имуноглобулин
ЛАУ - легионелен антиген в урина
ЛБ - Легионерска болест
Sg - серогрупа
MAb - моноклонално антитяло
PCR - полимеразно верижна реакция
След първите публикации от 1977 г, описващи драматичната епидемия от атипична пневмония в гр. Филаделфия, САЩ (1976 г. са 221 заболели с леталитет 15.38 %) и нейния причинител – Legionella pneumophila, става ясно че медицинската общественост е изправена пред ново препятствие – легионерска болест (ЛБ). „Предизвикателствата бяха легион“1. Какво причинява този епидемичен взрив? Откъде идва този „нов“ грам (-) бактерий? Защо не сме го открили по-рано? Как да го идентифицираме и да диагностицираме причинените от него болести? За отговори на тези въпроси от основно значение е разработването на надеждни микробиологични методи. Това се налага, защото без тях е невъзможно поставянето на диагноза ЛБ, която клинично, образно и клинико-лабораторно не може да бъде отличена от други пневмонии, наскоро описано и при български пациент2.
„Златен стандарт“ в микробиологичната диагностика остава изолирането на етиологичния причинител. Установено е, че „новият“ бактерий е много взискателен и не расте на известните към онзи момент бактериологични хранителни среди. Днес култивирането за легионела е възможно, но достъпно само в специализираните лаборатории. То е с изключителна важност при разшифроване на клъстъри и взривове на болестта и откриване на техните източници – основно антропогенни битови и промишлени водни системи. От друга страна, култивирането е с относително по-нисък принос към необходимата на клиницистите бързина за етиотропно насочване на терапията поради бавния растеж на легионелите (3-10 дни). След епидемията във Филаделфия се получават доказателства за възможностите на по-достъпното серологично изследване. Този метод е успешно прилаган както при ретроспективни проучвания, така и за диагностични цели, вкл. доказване (сероконверсия при 13) на първите 27 случаи на ЛБ у нас3. Резултати от тези български изследвания са потвърдени в тогавашната Германска федерална република. С годините се установи, че серологичните изследвания при ЛБ имат редица недостатъци, вече дискутирани от нас4. Основно това е необходимостта от седмици и дори месеци за доказване на сероконверсия. Само при около 40% от болните сигнификантно нарастване на антитяло титъра може да се очаква на втората седмица, но това е време, с което не всички пациенти разполагат….. 5
От 80те години на 20 век започва разработването на тестове за откриване на легионелен антиген в урина (ЛАУ). Днес положителен резултат от него при пациенти с пневмония е включен от Европейската работна група по легионелни инфекции като сигурен и практически водещ метод в бързото поставяне на етиологично „потвърдена диагноза ЛБ“, най-вече причинена от Legionella pneumophila Sg16.
Същевременно е възможно да се прилагат и други изследвания. Използват се моноклонални реагенти за директно визуализиране и идентифициране на причинителя и продължава подобряването на чувствителността и специфичността при PCR изследванията, но тези методи са все още подпомагащи и със стойност на „вероятна диагноза“ по отношение на ЛБ.
Цел
Представяне на резултати от разнородни микробиологични изследвания при 30 пациенти с ЛБ, диагностицирани в България.
Материали и методи
Материали: уринни (n=27) и първи серумни (n=20) проби; материали от долни дихателни пътища (n=11): храчка, трахеален аспират, плеврален пунктат, бял дроб.
Микробиологични методи:
Доказване на ЛАУ с експресни имунохроматографски тестове – ICT (CerTest Legionella, Biotec, Spain; Nadal Legionella Test, Germany; BinaxNOW Legionella, USA) и/или бърз ELISA метод (AccuDiag ELISA, Legionella Urinary Antigen, Diagnostic Automation, USA);
Определяне на: антитяло индекс (Abindex) чрез L. pneumophila Sg1-6 ELISA IgM+IgG (Vircell, Spain); антитяло титър чрез индиректна имунофлуоресценция (ИИФ) на същата фирма (при 1 вероятен, но денотифициран случай);
Култивиране върху специфичен BCYEaДоказване на легионелна нуклеинова киселина чрез in-house PCR (16S rRNA);
Визуализиране и идентификация на L. pneumophila чрез директна имуно-флуоресценция (ДИФ) с MAb (Monofluo, Bio-Rad, France).
Последните два метода са прилагани на подходящи за култивиране материали от долни дихателни пътища (ДДП).
Резултати:
В проучването първоначално бяха включени 32 пациенти. При един от тях за изследване бяха получени урина (отрицатена за L. pneumophila Sg1 антиген урия) и единична серумна проба, показала положителен ИИФ резултат за L. pneumophila Sg7-14 . Въз основа на това пациентът бе докладван в съответствие с Наредба 21/2005г като вероятен случай на ЛБ, но по същото време бе регистриран неговия фатален изход. Независимо от сериозната епидемиологична анамнеза (пътуване в страна с висока честота на ЛБ по време на инкубационния период), случаят бе денотифициран въз основа на положителен PCR резултат за грипна инфекция. При втори пациент бе получена само единична серумна проба. Изследването ѝ показа резултат на горната граница на сивата зона (Abindex=11). При незабавен контакт с изпращащото лечебно заведение бе установено, че пациентът е екзитирал. Нямаше възможност за други материали и изследвания, съответно – основание за нотифициране на случая. Въз основа на гореизложеното (но и с известни резерви – виж „Обсъждане“) изключихме тези двама болни от общия брой, представени по-нататък в раздела случаи.
ЛБ бе диагностицирана при 22 мъже и 8 жени във възрастовия диапазон от 3 до 78 г. (Фиг. 1).
Фиг. 1. Рентгенографски находки при български пациенти с потвърдена ЛБ
При 4 от всички диагностицирани (13%) болестта завърши фатално. За трима основна причина е късното искане за изследване за ЛБ (до над 10 дни от болничния прием по повод тежка пневмония). При двама това се случи от няколко до 24 ч преди смъртния изход, а при един легионелната инфекция бе установена post mortem. При четвъртият екзитирал пациент потвърдена ЛБ бе доказана още на 3-ия ден след болничния прием, но следва да се отбележи, че при хоспитализацията болният вече е бил с много тежка полиорганна недостатъчност.
Категорията на диагнозата при общо 28 пациента е „потвърдена ЛБ”. Основно (n=20) това бе отчетено при първоначално тестване на нативна урина с експресни ICT за ЛАУ (7 с BinaxNOW, 8 – Certest, 5- Nadal). Тези резултати бяха потвърдени при 17 болни и чрез изследване на термично инактивирани и онцентрирани урини по ELISA с оптична плътност на пробите от 0.220 до 3.358 при cut-off = 0.150 (Фиг. 2 А, Б)
Фиг. 2. Микробиологични методи в диагностиката на ЛБ при български пациенти
А – силно положителен резултат за ЛАУ чрез експресен ICT.
Б – доказване на ЛАУ чрез референтен бърз тест ELISA: A и B – положителна и отрицателна контроли; C, D и E – положителни проби от пациенти
В – растеж на L. pneumophila non-Sg1(L) на 7 ден от култивиране на храчка
Г – брилянтна ябълковозелена флуоресценция на интра- и екстрацелуларно разположени легионели в препарат от бял дроб, оцветен с MAb по ДИФ
Д – положителни PCR резулати за Legionella spp. от проби на пациенти: 1 – молекулен маркер, 2 и 3 – положителна и отрицателна контрола, 4 – храчка, 5 – плеврален пунктат
Доказването на ЛАУ чрез ICT Nadal бе неуспешно при други 3 пациенти, но същите материали, тествани с ELISA, демонстрираха положителни стойности, както следва: 0.181, 0.219 и 0.364.
За трима пациента не е приложен ICT, а е проведен само ELISA за ЛАУ с положителни стойности от 0.300 до 3.227. Като цяло диагностициране на ЛБ чрез детекция на ЛАУ (ICT и/или ELISA) бе постигнато при 26 болни (86.66%).
При останалите два потвърдени случая доказването на етиологичния причинител бе осъществено посредством „златния стандарт“ – култивиране на L. pneumophila (Фиг. 2В). Изолиране на легионели бе постигнато и в още 4 случая от правилно и навременно взети/изпратени храчки и трахеални аспирати.
Други суплементиращи диагностиката положителни резултати при проведените изследвания бяха, както следва: по три позитивни PCR и ДИФ реакции на материали от долни отдели на дихателна система (Фиг. 2, Г и Д) При един пациент положителни за „вероятна ЛБ“ тестове (PCR, ДИФ и L. pneumophila Sg1-6 първа серумна проба) на фона на отрицателен ЛАУ, своевременно насочиха етиотропната терапия до потвърждаването на диагнозата на 7-ия ден от култивирането на храчка с идентифициране на non-Sg1 L. pneumophila причинител.
От изследваните 20 първи серумни проби 14 (70%) бяха с отрицателен резултат (Abindex<9), една – със съмнителен (Abindex 9-11) и едва 5 с положителен резултат (Abindex>11). За двама пациенти от последната група (серологично позитивни) това бяха и единствените получени за изследване материали.
Обсъждане
С усъвършенстване на микробиологичните методи за диагностика на ЛБ по целия свят се отбелязва и съществен до рязък подем в докладването на случаи на болестта, като при някои териториално големи държави то достига до 249% за периода 2000-2011 г7.
Независимо че обикновено в клинични проби легионелите са в ниски количества и се култивират трудно, правилно и навременно взети материали от ДДП (неиндуцирана храчка, трахеален аспират/лаваж с dH2O, плеврален пунктат, белодробна тъкан) са основата за доказване на живи бактерии от род Legionella. Това се демонстрира и от успешно изолираните от нас 6 щама от едва 11 проби за култивиране (54.5%). Дори днес производството на диагностикуми за ЛБ е фокусирано върху детекцията на най-често срещания при хора (но не единствен) легионелен вид – L. рneumophila. Въпреки трудностите, съпровождащи култивирането и PCR изследванията, подходящите за тях материали от ДДП трябва да се изпращат при всяка възможност. Тези изследвания са основа за диагностиката и на други ~ 30 легионелни вида, които са докладвани като причинители на инфекции при човека, както и на откриването на нови патогенни видове, нерядко първично не от води, а от хора с пневмония, белодробен абсцес и дори нативен ендокардит 8-11.
В Европа ~ 90 % от ЛБ през 2012 – 2015 г. e диагностицирана чрез ЛАУ12. Това изследване се доказа като водещо (86.6 %) и при българските ЛБ пациенти, представени тук. Притеснителен факт бе регистриран при 3 урини с отрицателен резултат чрез ICT Nadal, но демонстриращи положителни стойности по ELISA метод. Макар и ограничени по брой, тези данни сочат възможността за фалшиво отрицателни резултати при използване на ICT Nadal, какъвто феномен не сме наблюдавали при другите използвани от нас експресни ICT, паралелно с ELISA. Това може да се дължи, от една страна, на ниски нива на екскреция на ЛАУ в някои от случаите, а от друга – на особености в субтипа на легионелния щам причинител, напр. инфекция с L. рneumophila моноклонален субтип MAb 3/1 отрицателен. За съжаление в търговската документация на много от тестовете липсва информация за използваната производствена матрица и диагностичния праг, което сериозно затруднява подбора на китове.
Независимо от индикираните възможни проблеми, към момента няма друг метод с капацитета на ЛАУ за L. pneumophila Sg1 по отношение на бързина, специфичност, чувствителност, липса на необходимост от високоспециализирана апаратура и скъпи консумативи.
Прави впечатление ниският процент на положително реагиращи единични серумни проби (в едва 16 % от диагностицираните случаи). За адекватна реакция на имунната система при някои пациенти са необходими 4-6-9 седмици, а при 20 – 30 % сероконверсия не настъпва, независимо че заболяването е доказано културелно5. Тези данни демонстрират ниската надежност при изследване само на серумна проба.
Тестове като PCR и ДИФ не различават живи от умрели легионели. В добавка те изискват правилно подбрани, често инвазивно взети проби, скъпо оборудване и опитен в прилагането им и интерпретацията на резултата персонал. Въпреки това, те имат своето значение в общата схема на възможни изследвания при ЛБ като относително бързи и насочващи до излизане на потвърдителен резултат или отчитане на клинично подобрение. Такъв бе случаят при двама културелно потвърдени наши пациенти, за които първоначално имахме само положителни PCR и/или ДИФ резултати.
Повод за размисъл будят два фатално завършили случая с неуточнен легионелен статус. При първият, серологично положителен за L. pneumophila non-Sg1, но денотифициран поради PCR+ резултат за грип, трябва да се обърне внимание на нередките ко-инфекции с легионели и други микроорганизми. Като правило те са и с по-тежък клиничен ход. ЛБ е докладвана в комбинация с вируси (грипни и херпесни вируси, цитомегаловируси), други бактерии (S. pneumoniae, S. aureus, M. tuberculosis, H. influenzae, Nocardia spp., Prevotella intermedia и др.), гъбички (Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis jiroveci), както са съобщавани ЛБ случаи вследствие инфектиране с различни видове или Sg легионели13,14. Предвид представените по-горе данни от изследване на единични серумни проби, полученият резултат на горна граница на сива зона при втория недокладван пациент (Abindex =11), оставя нашите предположения също в „сивата зона“…..
Само при 6 от разгледаните пациенти в НРЛ ООБИ е изпратен материал за референтно изследване. Това сочи, от една страна, за недостатъчна готовност за диагностика на ЛБ в редица лечебни заведения, а от друга – за незаявяването на подобни тестове от страна на клиниките. Неглижирането и недиагностицирането на ЛБ се демонстрира и от нереално ниския брой докладвани случаи в България спрямо други страни и даже спрямо случаите на чужди граждани, заболели след престой в България (данни на EWGLI/ELDSNet и НРЛ ООБИ). Според средните стойности в докладването на ЛБ в Европа, ежегодно при липса на взривове, болестта трябва да се диагностицира при поне 150 – 200 български граждани. Друг проблем, произтичащ от хиподиагностиката, е невъзможността да се откриват източник-свързани случаи на ЛБ, а оттам – липсва бдителност и нормативно базирани саниращи мероприятия в многобройните рискови обекти – водни охладителни кули, болници, хотели/места за настаняване, спа-центрове и др.
Доказването на ЛБ случай е не само в полза на пациента и лекуващия екип, но има значение и за общественото здравеопазване, с оглед овладяване или предотвратяване на клъстъри и епидемични взривове на болестта, които нерядко достигат стотици случаи с общ източник15-19
В по-тесен план, дори ако първоначално се прояви като лека или средно тежка пневмония, недиагностицираната ЛБ често води до рязко влошаване с превеждане на пациента от стационар в интензивно отделение в рамките на ~ 30 мин. ЛБ е втората по честота (след пневмококовата) бактериална пневмония, изискваща директен прием в интензивно отделение, но е водеща по леталитет и продължителност на хоспитализацията20. При представените наши пациенти най-дългият регистриран болничен престой е 42 дни, а леталитетът е 13%.
За оптимален вариант при диагностика на ЛБ се счита навременното изпращане на пул от проби (урина, материал от ДДП, серум) и ЛБ- насочени анамнестични данни (професия, нерегулярни активности 14 дни преди начало на симптомите – например нощуване извън дома, хоспитализация/медицински манипулации, включително стоматологични и др.). Така е възможен индивидуален подход при подбора на видовете изследвания и интерпретацията на резултата при различните случаи.
Поради сериозната честота и значимост на ЛБ и пневмококовата пневмония, за тях са разработени експресни методи с ICT за доказване на съответния бактериален антиген в урина, което самостоятелно при положителен резултат е критерий за „потвърдена диагноза“. На практика се препоръчва при прием на пациенти с пневмония в интензивни отделения тези тестове да се правят на място, а независимо от експресния резултат, клинични проби да се изпращат за референтно изследване по по-трудоемки, но и по-чувствителни методики.
Литература
1. Fraser DW. The challenges were legion. 2005. Lancet Infect Dis 5:237–241.
2. Коцев С., И. Томова, Д. Иванов. и съавт. Легионерска болест, усложнена с развитие на остър респираторен дистрес синдром и пневмоторакс. INSPIRO, 2020, 55(2); http://inspiro-bg.com/author/s-kotsev/
3. Томов, А. 1986. Легионелоза. Медицина и физкултура, София.
4. Томова, И., Г.Чавдарова, Р.Ненова и съавт. Бърза и точна диагностика на Легионерска болест: серум vs. урина. Medical Magazine 2016/11, 35, 50-52.
5. Edelstein P. Legionella. In: Manual of Clinical Microbiology, 10th ed., 2011. ASM Press, Washington, DC., 770-785.
6. https://www.ecdc.europa.eu/en/surveillance-and-disease-data/eu-case-definitions.
7. Dooling K., K.-A.Toews,L.Hicks, et al. Active Bacterial Core Surveillance for Legionellosis — United States, 2011–2013. MMWR 2015, 64 (42),1190-1193
8. Pearce M., N. Theodoropoulos, M. Mandel, et al. Legionella cardiaca sp. nov., isolated from a case of native valve endocarditis in a human heart. Int J Syst Evol Microbiol. 2012, 62(12), 2946–2954.
9. Palmer А., J.Painter, H.Hassler, et al. Legionella clemsonensis sp. nov.: a green fluorescing Legionella strain from a patient with pneumonia. Microbiol.Immunol. 2016,60(10),694-701.
10. Relich R., B. Schmitt, H. Raposo, et al. Legionella indianapolisensis sp. nov., isolated from a patient with pulmonary abscess. Int.J.Infect.Dis. 2018,69,26-28.
11. Edelstein P., M.Edelstein, L.Shephard, et al. Legionella steelei sp. nov., isolated from human respiratory specimens in California, USA and South Australia. Intern.J.Sys.Evol.Microbiol. 2012,62,1766–1771.
12. Beauté J, on behalf of the European Legionnaires’ Disease Surveillance Network. Legionnaires’ disease in Europe, 2011 to 2015. Euro Surveill. 2017;22(27):pii=30566.
13. Roig J., J. Rello. Legionnaires’ disease: a rational approach to therapy. J. Antimicrob. Chemother. 2003,51, 1119–1129
14. Wewalka G, D. Schmid, T.G. Harrison, et al. Dual infections with different Legionella strains. Clin Microbiol Infect. 2014,20, O13- O19.
15. Shivaji T, Sousa Pinto C, San-Bento A, et al. A large community outbreak of Legionnaires disease in Vila Franca de Xira, Portugal, October to November 2014. Euro Surveill. 2014,18;19(50):20991.
16. García-Fulgueiras A., C. Navarro, D. Fenoll, et al. Legionnaires’ Disease Outbreak in Murcia, Spain. Emerging Infectious Diseases 2003, 9(8),915-921
17. NguyenT., D. Ilef, S. Jarraud, et al. A Community-Wide Outbreak of Legionnaires Disease Linked to Industrial Cooling Towers-How Far Can Contaminated Aerosols Spread? J.Infect.Dis. 2006,193(1),102-11.
18. Nygard K., Ø.Werner-Johansen, S. Rønsen, et al. An Outbreak of Legionnaires Disease Caused by Long-Distance Spread from an Industrial Air Scrubber in Sarpsborg, Norway. Clin.Infect.Dis. 2008,46(1),61–69.
19. Den Boer J., Ed P.F. Yzerman, J. Schellekens, et al. A large outbreak of Legionnaires‘ disease at a flower show, the Netherlands, 1999. Emerg Infect Dis. 2002,8(1),37-43.
20. Vergis N., E. Abkas, V. L. Yu. 2000. Legionella as a cause of severe pneumonia. Semin. Respir. Crit. Care Med. 21, 295–304