Станислав Янев
Георги Чалдъков
Научният потенциал на водещите страни в света е в надпревара за тестиране на наличния фармакологичен ресурс от регистрирани антивирусни средства при новата пандемична обстановка. Направени са над 80 клинични опити за оценка на ефективността на лечението срещу новия коронавирус: Sever Acute Respiratory Syndrome CoV-2 (SARS-CoV-2) (Фиг. 1). Това са антивирусни лекарства, които са били използвани при други инфекции, одобрени са и знаем, че са относително с малко нежелани ефекти1,2.
Фиг. 1. Схема на коронавирус. Във вирусната мембрана са разпо- ложени transmembrane spike (S) glycoproteins (S-гликопротеини), които имат важно участие за влизането на вируса в клетката. S-гликопротеините трябва да се „обработят“ (cleave, cleavage) от действието на клетъчни протеази (например, фурин; S-гликопртеините имат furin cleavage site), за да се осъществи сли- ването на вируса с клетъчната мембрана и, съответно, вливането на вируса в клетката. Следователно, инхибитори на фурин и други протеази могат да имат антивирусен ефект3
I. Борба с вирусната инфекция по пътя на вируса в клетката
Вирусите влизат в клетките по два основни начина: (1) receptor-mediated endocytosis (RME) и (2) receptor-mediated virus-cell fusion (receptor-mediated fusion – RMF)4,5. В 1990 г. един от нас (Г.Ч.) публикува хипотезата си за инхибиране на RME на вируси като възможност за антивирусна терапия, включително за acquired immunodeficiency syndrome (AIDS, на български, СПИН)6.
От наскоро публикувания ни обзор върху възможните пътища за блокиране на клетъчното проникване на различни вируси, включително human immunodeficiency virus (HIV), могат да се направят няколко заключения7.
Първо, не можем да сме сигурни, че ефективни антивирусни средства срещу една вирусна инфекция ще бъдат ефективни спрямо друга такава. И още по-важно, след дълги години на борба за потискане на вторичната инфекция при болните от СПИН чрез прилагането на инхибитори на полимеразната реакция, успех бе постигнат едва след като към лечението се прибави лекарство за инхибиране на влизането (интернализиране) на вируса в клетката.
Високо иновативните методи на молекулната биология и вирусология позволиха на учените много бързото идентифициране на структурата на новия коронавирус (Фиг. 2).
SARS-CoV-2 е обвит, позитивно, едноверижен РНК бета-коронавирус. Подобно на SARS-CoV и Middle EastRespiratory Syndrome CoV (MERS-CoV), геномът на SARSCoV-2 кодира предимно неструктурни протеини (3-химотрипсин-подобна протеаза, папаин-подобна протеаза, хеликаза и РНК-зависима РНК полимераза) и структурни протеини (например, спайк S-гликопротеин). Четирите неструктурни протеини са ключови ензими за вирусния жизнен цикъл, а S-гликопротеинът е незаменим за взаимодействието с клетъчните рецептори по време на вирусното влизане. Следователно, тези пет протеина са подходящи като прицелни цели за разработване на антивирусни средства срещу SARS-CoV-2. Те следват логично пътя на проникване на вируса в таргетната клетка, освобождаване на вируса от протеиновата му обвивка с помощта на протеазите, репликация на вирусната РНК, възстановяване на новия вибрион.
Фиг. 2. Геномна организация на SARS-CoV-2. От:
I.1. Рецепторна клетъчна входна врата
Различните вируси чрез определени участъци на протеиновата си обвивка [receptor binding domain (RBD) of spike glycoprotein] се свързват със селективни домейни на рецепторите си, локализирани в клетъчната мембрана (плазмалема)5. Наличието и степента на експресиране на тези рецептори в значителна степен предопределят специфичността на патологичните промени след вирусната атака в определени клетки, тъкани и органи. За ре-спираторните вируси това са различни епителни клетки на устната кухина, бронхите и алвеолите.
Фиг. 3. Схема на белодробна алвеола и алвеоларни клетки
Това взаимодействие вирус-клетка е рецептор-медииран процес, водещ до сливане на вируса с клетъчната мембрана, последвано от влизането на вируса в клетката. То се осъществява от свързването на коронния S-гликопротеин с рецептора на CoV-2 – ангиотензинконвертиращ ензим 2 (Angiotensin Converting Enzyme – ACE2). S-гликопротеин на CoV-2 е като този на CoV от епидемията през 2003 г.
Анализ на Human Protein Atlas database показва, че белодробните клетки, експресиращи АСЕ2 са изключително малко, но в същото време съдържат много други гени, позитивно регулиращи вирусната репродукция и трансмисия. АСЕ2 в по-голяма степен е наличен в плазмалемата на артериални и венозни ендотелни клетки и артериални гладкомускулни клетки, в епителни клетки на черва, бъбреци, тестиси, жлъчен мехур и мозък, което показва, че проникването на вируса в организма може да се осъществи не само по респираторен път9. Възниква въпросът защо тези органи нямат тежки патологични и клинични прояви от коронавирусната инфекция, както белия дроб?
АСЕ2: физиология и патология
АСЕ2 е един от крайните етапи, регулиращ веригата пептиди с важни функции за сърдечносъдовата, бъбречната и респираторната система на организма. Накратко, АСЕ2 играе важна балансираща роля за поддържане на равновесието между нивата на Ang II (молекула с пресорна, пролиферативна, профибротична и протромботична активност, реализираща се чрез AT1 и AT2 рецептори) и Ang-(1-7) (молекула с вазодилататорна, антипролиферативна, антифибротична и антитромботична активност, реализираща се чрез взаимодействие с MAS G protein-coupled receptor). Това добре се вижда от схема, описваща ренин-ангиотензиновата система с възможни места на въздействие за компенсиране на ефекта на коронавируса (Фиг. 4).
При активирането на RAS каскадата ренинът метаболизира ангиотензиногена до Ang I, който след това се превръща в Ang II от ACE. Ang II чрез своите рецептори (AT1 и AT2) упражнява локални и системни ефекти, като вазоконстрикция и стимулиране на освобождаването на алдостерон. ACE2 функционира като антирегулаторен ензим за балансиране на отговорите, инициирани от AСЕ. ACE2 метаболизира Ang I и Ang II до Ang-(1–9) и Ang-(1–7). Чрез свързване с MAS рецептора, Ang-(1-7) антагонизира Ang II-медиираните действия.
Накратко, ACE2 е плазмалемален протеин, чийто ектодомейн е (1) ензим в метаболизма на ангиотензина и (2) рецептор за влизане на CoV-2 в клетка. С други думи, ACE2 има каталитичен домейн и домейн за свързване с коронавирусните S-гликопротеини. Инхибирането на експресията на ACE2 от CoV-2 може да наруши баланса на функциите на ACE-ACE2, които могат да бъдат възстановени от различни терапевтични подходи (вижте А-D във Фиг. 4).
Фиг. 4. Потенциални терапевтични подходи за лечение CoV-2 индуцираното белодробно увреждане, ба
В клинично изследване на болни, заразени със CoV-2, са установени важни корелати: нивото на ангиотензин II в плазмата е значително повишено и линейно свързано с вирусния титър и увреждането на белите дробове.Резултати предполагат и използването на ангиотензин рецепторни блокери (Лозартан), като потенциални лекарства за симптоматично лечение на COVID-1913.
Нивото на експресия на ACE2 в различни тъкани е от решаващо значение за симптоматиката на COVID-19.
Предварителни данни говорят за наличие на значителни разлики в експресията на АСЕ2 в различните тъкани на пациенти от източно-азиатски и европеиден произход, по-висока експресия и по-голяма чувствителност към инфекцията при първата група14,15. Има данни, че тютюнопушенето индуцира АСЕ2 в дихателните пътища, което предполага, че пушачите биха имали по-висока чувствителност към SARS-CoV-2 инфекцията16.
Блокиране на навлизането на вируса в клетката на нивото на рецептора
Хлорохин (chloroquine) е доказан кандидат за модулиране на вирусното клетъчно проникване и вирусната репликация. Това противомаларийно лекарство се оказва с антивирусно действие. Хлорохинът е лизозомотропно химическо вещество, което повлиява вирусната инфекция чрез потискане на ацидифицирането на ендозомите – мембранооградени органели на лизозомалния клетъчен апарат, където действа вакуоларната H+-АТ фаза17. Това води до повишаване на pH в ендозомите, което блокира (1) дисоциирането на вируса от ACE2 рецептора, (2) отделянето му в цитоплазмата и (3) вирусната репликация и инфекция17. Затова хлорохин е прилаган за терапия на вирусни болести, зависими от кисело pH в ендозомите18.
Накратко, хомеостазата на ендозомалните pH-зависими протеази е важен клетъчен феномен, който заслужава по-нататъшни изследвания във фармакотерапията на настоящата CoV-2 пандемия19.
Хлорохинът има и имуномодулиращи свойства, повишавайки синергично своя противовирусен ефект20. Той
вече се тества в 23 клинични изследвания при пациенти с пневмония, причинена от коронавирус21. Първите резултати са обнадеждаващи. Трябва да се отбележи, че за успешната терапия с хлорохин важно значение има времето на прилагането му. Той би бил по ефективен и по-малко токсичен в началната фаза на развитие на инфекцията, т.е до 5-7-и ден. Това е логично, като се има предвид действието му в първия етап на вирусната атака – навлизането и репликацията на вируса в клетката. Успешни клинични резултати са наблюдавани и след комбинираното му прилагане с антибиотика azithromycin, прилаган за блокиране на евентуалното развитие на вторична бактериална инфекция.
I.2. Клетъчна протеаза
Клетъчната серин протеаза (transmembrane protease, serine 2, TMPRSS2) улеснява проникването на вируса през клетъчната мембрана. Има клинични опити за селективно инхибиране на тази протеаза с камостат мезилат22.
Лопинавир и ритонавир са два протеазни инхибитора, използвани за лечение на AIDS, блокирайки окончателното му развитие. Имайки предвид, че протеазата на Cov-2 се оказа сходна с тази на HIV, тази комбинация вече е тествана с променлив успех при пациенти с COVID-19.
I.3. Блокиране на репликацията на вирусната РНК
Ремдезивир е един от тези антивирусни препарати, които са тествани при хора. Това широкоспектърно ан-
тивирусно лекарство, което все още се изследва, бе използвано срещу ебола и коронавирусите, причиняващи SARS и MERS. Ремдезивир е аналог на аденозина, включен във веригата на вирусната РНК и така блокира репликацията й20.
Favipiravir – механизмът на неговото действие е свързан със селективно инхибиране на вирусната RNAdependent RNA polymerase. Favipiravir е prodrug, който се метаболизира до своята активна форма, favipiravirribofuranosyl-5‘-triphosphate (favipiravir-RTP), от човешката hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT)23.
Сред останалите предложени терапевтични подходи, някои се основават на употребата на озелтамивир (инхибитор на невраминидазата, използван срещу грипния вирус) и интерферон бета-1b (протеин с антивирусна функция).
II. Използване на най-новите постижения на генетиката, молекулната биология и биотехнологиите за намиране на бърза диагностика и лечение
Скоростта на разпространение на заразата изисква бързи методи за диагностициране на вирусоносителите.
Експертите предполагат, че броят на хората, носите ли на вируса без болестни прояви или с такива, на които не обръщат сериозно внимание, е много голям и те са практически основният резервоар за разпространение на инфекцията. Тестирането за носителство на контактните лица на болни със сериозна симптоматика чрез международно валидирани тестове изискват време и средства. И според един от нас (С.Я.) води до изкривени статистически данни за броя на заразените, болните и смъртните случаи. Лекарите в известната Mount Sinai Hospital в Ню Йорк предлагат за утвърждаване нов бърз „полеви” тест за диагностика на вирусоносителство чрез използване на нова микрофлуидна технология, позволяваща PCR методология на нано ниво.
Отново, познанията за рецептора АСЕ2, вирусните S-гликопротеини и клетъчните протеази, необходими за проникването на Cov-2 в клетките, предоставят нови подходи за лечение на COVID-19. Например, пречистването на вирусния S-гликопротеин предполага използването му за „насищане” на рецептора и по този начин за спиране на вирусната интернализация, репликация и инфекция.
В момента можем да разграничим три нови подхода за блокиране на проникването на вируса в таргетната клетка (Фиг. 5):
1. Рецептор-свързващ домейн (RBD) на S-гликопротеина на CoV-2 се изолира и се прилага отделно, като по този начин лигира (свързва се) ACE2 и насища наличните му свързващи места.
2. Алтернативно, срещу ACE2 може да се приложи антитяло или фрагмент от едноверижни антитела (scFv), за да се постигне същото насищане.
3. Атакуват се коронавирусните вириони директно с помощта на извънклетъчния домейн на АСЕ2, като стръв, насочена за свързване с S-гликопротеин. Fc домейнсвързан с ACE2 би улеснило продължителното му циркулиране в биологична среда (ACE2-Fc).
4. За блокиране на проникването на вируса в клетката служи изработването на кристален модел на RBD. Данните, получени от RBD-докинг експерименти са използвани за картографиране на RBD-рецепторни взаимодействия, които биха могли да бъдат използвани за проектиране на малки молекулни инхибитори на свързващото място. След виртуален скрининг на над 3000 съединения е намерено и вече потвърдено в опити, че две съединения от антрациклиновата лекарствена група (zorubicin и aclarubicin), както и food dye (E 155) са мощни инхибитори на RBD на вирусните S-гликопротеини за ACE2 рецепторите25.
Фармакологичните перспективи за терапия на коронавирусната болест (COVID-19) са представени обобщено на Фигура 6.
Фиг. 5,6
Възможният български принос
В същата посока са и опитите за използване на антителата в серумите на преболедували хора или създаване на моноклонални антитела за неутрализиране на вируса като терапевтични подходи. Такъв терапевтичен подход в момента усилено се разработва в National Institutes of Health, Frederick, Maryland, USA, в който водещ участник е един от най-изявените български молекулярни биолози Димитър С. Димитров26. Ние в Отворено писмо се обърнахме към съответните държавни институции с предложение да потърсят неговото мнение за перспективите на превенция и терапия на COVID-19. В Писмото, озаглавено „Е (на глупостта) = mc2. Ефектът на Дънинг-Крюгер е много вреден“ написахме: „…Следователно, да се забрани на необразовани и незнаещи да говорят за 2019-nCoV и лечение на COVID-19. Сега компетентните вирусолози, инфекционисти, пулмолози и фармаколози са капитани на кораба. Най-знаещият от тях е световно признатият български учен професор Димитър С. Димитров, който от 25-30 години работи в САЩ….“ (www.eurochicago.com, 11 март 2020; вестник „168 часа“, 19-25 март 2020 – интервю със С.Я.).
III. Други потенциални терапевтични подходи
III. 1. АСЕ инхибитори като антивирусни средства
Широко използваните АСЕ инхибитори (каптоприл, еналаприлат, лизиноприл) като лекарства за регулиране на нивото на ангиотензин II и съдовия тонус, се свързват с каталитичния център на АСЕ2, без да го инхибират. Би било важно да се покаже дали тези ензимни инхибитори могат косвено да променят конформацията на мястото на свързване на вируса (RBD) и по този начин това да се отрази на взаимодействието на ACE2 с вируса. Със сигурност е полезно да се тестват тези лекарства за способността им да блокират RBD-ACE2 взаимодействие27. Полезна информация по този въпрос би било наблюдението на нивото на антивирусна защита на хилядите сърдечно болни, приемащи като основна терапия АСЕ инхибитори.
III. 2. В начален стадии на изследване са вещества с потенциал да намалят експресията на АСЕ2, намерени след анализ на базите данни28:
1. Connectivity Map (CMap) –Azathioprine
2. JeaMoon Map (JMap) (traditional Chinese medicine): Andrographis, Urtica, Sambucus, Astragalus, valproic acid, butyrate, andepoxomicin
III. 3. Нови вещества с потенциална антивирусна активност
Арицитиниб - вече разрешено лекарство за ревматоиден артрит, чиято потенциална ефективност срещу коронавируса бе установена благодарение на методите на изкуствения интелект29.
Проучване на италиански медици показва много добри резултати в това направление с имуносупресивно лекарство за лечение на ревматоиден артрит –Tocilizumab, хуманизирано моноклонално антитяло срещу интерлевкин-6 рецептора (IL-6R)30.
Lycorine, алкалоид, застъпен във висока концентрация заедно с галантамина в родното ендемично „блатно” кокиче Leucojum aestivum (Amaryllidaceae), е показал висока антивирусна активност (EC50=1.63 μM) спрямо MERS-CoV, като същевременно протектира BALB/c мишки срещу смъртността от HCoV-OC43, като намалява вирусното натоварване на централната нервна система2,31. Той притежава и други полезни биологични активности, като антиеметична, противотуморна и антивъзпалителна активност с релаксиращ ефект върху бронхиалната мускулатура.
III. 4. Диета, хранене, селен и цинк и coronavirus1
Няма нищо учудващо, че руски колеги не са намерили следи от цинк в болни от COVID-19. Състоянието на цинковата хомеостаза в организма се отразява най-малкото по два механизма на развитието на вирусната инфекция.
1. ACE2 e металоензим с един атом цинк към една от протеиновите вериги. Приемането на цинк чрез храната или други синтетични средства (20 mg дневно) по време на лечението и след него би имало стимулиращ ефект за по-бързото възстановяване на организма27.
2. Има данни, че улесняване проникването в клетката на екстрацелуларния цинк от някои вещества (йонофори), като пиритион и хлорохин, в ниски концентрации инхибират вирусната RNA-зависима RNA полимераза на SARS-CoV32,33.
3. Интересно изследване показва, че в протеиновата обвивка на самия вирус има лабилно свързан цинк
към цистеин, участващ в поддържане на структурата на вирусната обвивка. Това предполага изпитването на Zn-свързващи препарати, като средства за нарушаване на структурата и функцията на вируса. При комбинираното прилагане на дисулфирам с интерферон на пациенти, инфектирани с коронавирус, са постигнати обнадеждаващи резлтати34.
Селенът също се препоръчва като важен фактор на „антиоксидантната” защита (100 mcg дневно) на инфекциозно болни35.
Витамин С в дневни дози от 3000 mg, приети разделно, има определено положителен ефект36.
III. 5. Подходи за нови специфични антивирусни лекарства
1. Чрез in silico симулиране и бързодействуващи компютърни мрежи? Позволяваме си кратък коментар по въпроса, стимулиран от некомпетентната претенция на една бизнес/научна група от София, че „само” 8 милиона лева са им нужни, за да завършат внедряването на нова молекула за лечение на COVID-19. Това, че търсенето на най-оптималната химическа структура на взаимодействие на едно вещество с даден биологичен обект се извършва с милиони комбинации за секунда, не е гаранция за постигане на успех. Един пример от моите (С.Я.) студентски години през 1962-1963, когато с удоволствие слушах заедно с моята съпруга (студентка по математика и информатика) лекция на доц. Благовест Сендов, посветена на използването на първата голяма компютърна машина МИНСК-2 за прогностични цели. Запитали тогава машината какво трябва да яде един студент по математика всеки ден, за да поддържа физическото и умственото си състояние на добро ниво. Машината отговорила (предполагам след няколко минути!): един литър олио и половин хляб! Поуката: резултатът от една такава задача, даже и сега при използване на изкуствения интелект, зависи от това как е съставен въпроса, алгоритъма, т.е от професионализма на експериментатора.
2. И още нещо за бързото и чудодейно предвиждане на високо ефективни лекарствени молекули чрез бързодействащи компютърни мрежи. Ако този подход беше толкова ефективен, нямаше големите фармацевтични компании да организират експедиции, примерно в амазонските джунгли, и да питат туземците какво е това мазило, с което си лекуват дадено заболяване!
Финално послание
Надяваме се, че описаните в този кратък обзор възможности на съвременната фармакология да се справи с атаката на новия коронавирус отговарят на повика на световната научна общност: сподели с всички научната информация, за постигане на общия успех! С други думи, dissemination-of-knowledge (DOK) is an essential component of basic, clinical and translational research.
Литература
1. Zhang L, Liu Y. Potential interventions for novel coronavirus in China: A systematic review. Journal of Medical Virology 2020; 92(5): 479-490. [DOI:10.1002/jmv.25707]
2. Shen L, Niu J, Wang C, Huang B, Wang W, Zhu N, et al. High-Throughput Screening and Identification of Potent Broad-Spectrum Inhibitors of
Coronaviruses. Journal of virology 2019; 93(12): e00023-00019. [DOI: 10.1128/JVI.00023-19]
3. Shiryaev SA, Remacle AG, Ratnikov BI, Nelson NA, Savinov AY, Wei G, et al. Targeting host cell furin proprotein convertases as a therapeutic strategy against bacterial toxins and viral pathogens. J Biol Chem 2007; 282(29): 20847-20853. [DOI: 10.1074/jbc.M703847200]
4. Dimitrov DC. HIV-1 infection of cells and AIDS progression. Biomed Rev 1993; 2 (1-8.5. Chaldakov GN. Intracellular fusogens and antifusogens in HIV-1-CD4 mediated membrane fusion? Biomed Rev 1993; 2(79-80.6. Chaldakov GN. Inhibition of receptor-mediated cellular entry of viruses
including HIV: a perspective on further researches on chemotherapy in viral diseases including AIDS. Med Hypotheses 1990; 33(4): 265-268. [DOI:10.1016/0306-9877(90)90140-a]
7. Chaldakov G, Yanev S. RME-based pharmacology: the inhibition of viral entry as therapeutic perspective in viral diseases including aids. Hypothesis updated and enlarged. Biomed Rev 2018; 29(109-118.
8. Li G, De Clercq E. Therapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV). Nature Reviews Drug Discovery 2020; 19(149-150 [DOI: 10.1038/d41573-020-00016-0]
9. Chen Y, Guo Y, Pan Y, Zhao ZJ. Structure analysis of the receptor binding of 2019-nCoV. Biochemical and Biophysical Research Communications 2020. [DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.02.071]
10. Wu Y. Compensation of ACE2 Function for Possible Clinical Management of 2019-nCoV-Induced Acute Lung Injury. Virologica Sinica 2020. [DOI:10.1007/s12250-020-00205-6]
11. Imai Y, Kuba K, Ohto-Nakanishi T, Penninger JM. Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2) in Disease Pathogenesis. Circulation Journal 2010; 74(3):405-410. [DOI: 10.1253/circj.CJ-10-0045]
12. Ferrario CM. ACE2: more of Ang-(1-7) or less Ang II? Curr Opin Nephrol Hypertens 2011; 20(1): 1-6. [DOI: 10.1097/MNH.0b013e3283406f57]
13. Liu Y, Yang Y, Zhang C, Huang F, Wang F, Yuan J, et al. Clinical and biochemical indexes from 2019-nCoV infected patients linked to viral
loads and lung injury. Science China Life Sciences 2020; 63(3): 364-374. [DOI:10.1007/s11427-020-1643-8]
14. Cao Y, Li L, Feng Z, Wan S, Huang P, Sun X, et al. Comparative genetic analysis of the novel coronavirus (2019-nCoV/SARS-CoV-2) receptor
ACE2 in different populations. Cell Discovery 2020; 6(1): 11. [DOI: 10.1038/s41421-020-0147-1]
15. Zhao Y, Zhao Z, Wang Y, Zhou Y, Ma Y, Zuo W. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv 2020:2020.2001.2026.919985. [DOI: 10.1101/2020.01.26.919985]
16. Wang J, Luo Q, Chen R, Chen T, Li J. Susceptibility Analysis of COVID-19 in Smokers Based on ACE2. Preprints 2020 2020; v1(2020030078). [DOI:10.20944/preprints202003.0078.v1]
17. Chaldakov G. Cell Biology. 2th updated and enlarged edition ed. Varna: University Press, 2014.
18. Kearney J. Chloroquine as a Potential Treatment and Prevention Measure for the 2019 Novel Coronavirus: A Review. Preprints 2020, 2020030275 2020. [DOI: 10.20944/preprints202003.0275.v1]
19. Al-Bari MAA. Targeting endosomal acidification by chloroquine analogs as a promising strategy for the treatment of emerging viral diseases.
Pharmacology research & perspectives 2017; 5(1): e00293-e00293. [DOI:10.1002/prp2.293]
20. Wang M, Cao R, Zhang L, Yang X, Liu J, Xu M, et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus
(2019-nCoV) in vitro. Cell Research 2020; 30(3): 269-271. [DOI: 10.1038/s41422-020-0282-0]
21. Cortegiani A, Ingoglia G, Ippolito M, Giarratano A, Einav S. A systematic review on the efficacy and safety of chloroquine for the treatment of COVID-19. Journal of Critical Care 2020. [DOI: 10.1016/j.jcrc.2020.03.005]
22. Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Kruger N, Herrler T, Erichsen S, et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell 2020. [DOI: 10.1016/j.
cell.2020.02.052]
23. Jin Z, Smith LK, Rajwanshi VK, Kim B, Deval J. The Ambiguous Base-Pairing and High Substrate Efficiency of T-705 (Favipiravir) Ribofuranosyl
5′-Triphosphate towards Influenza A Virus Polymerase. PLOS ONE 2013; 8(7): e68347. [DOI: 10.1371/journal.pone.0068347]
24. Kruse RL. Therapeutic strategies in an outbreak scenario to treat the novel coronavirus originating in Wuhan, China. F1000Research 2020; 9(72-72. [DOI: 10.12688/f1000research.22211.2]
25. Senathilake K, Samarakoon S, Tennekoon K. Virtual Screening of Inhibitors Against Spike Glycoprotein of 2019 Novel Corona Virus: A Drug
Repurposing Approach. Preprints 2020, 2020030042 2020. [DOI: 10.20944/ preprints202003.0042.v1]
26. Wang L, Xu J, Kong Y, Liang R, Li W, Li J, et al. Engineering a Novel Antibody-Peptide Bispecific Fusion Protein Against MERS-CoV. Antibodies
(Basel) 2019; 8(4). [DOI: 10.3390/antib8040053]
27. Guy JL, Jackson RM, Acharya KR, Sturrock ED, Hooper NM, Turner AJ. Angiotensin-Converting Enzyme-2 (ACE2): Comparative Modeling of
the Active Site, Specificity Requirements, and Chloride Dependence. Biochemistry 2003; 42(45): 13185-13192. [DOI: 10.1021/bi035268s]
28. Cui Q, Huang C, Ji X, Zhang W, Zhang F, Wang L. Possible Inhibitors of ACE2, the Receptor of 2019-nCoV. Preprints 2020 2020; v1([DOI: 10.20944/preprints202002.0047.v1]
29. Richardson P, Griffin I, Tucker C, Smith D, Oechsle O, Phelan A, et al. Baricitinib as potential treatment for 2019-nCoV acute respiratory disease. Lancet 2020; 395(10223): e30-e31. [DOI: 10.1016/S0140-6736(20)30304-4]
30. Ohsugi Y. The immunobiology of humanized Anti-IL6 receptor antibody: From basic research to breakthrough medicine. Journal of Translational Autoimmunity 2020; 3(100030. [DOI: 10.1016/j.jtauto.2019.100030]
31. Pillaiyar T, Meenakshisundaram S, Manickam M. Recent discovery and development of inhibitors targeting coronaviruses. Drug Discovery Today 2020. [DOI: 10.1016/j.drudis.2020.01.015]
32. te Velthuis AJW, van den Worm SHE, Sims AC, Baric RS, Snijder EJ, van Hemert MJ. Zn2+ Inhibits Coronavirus and Arterivirus RNA Polymerase Activity In Vitro and Zinc Ionophores Block the Replication of These Viruses in Cell Culture. PLOS Pathogens 2010; 6(11): e1001176. [DOI: 10.1371/journal.ppat.1001176]
33. Xue J, Moyer A, Peng B, Wu J, Hannafon BN, Ding W-Q. Chloroquine Is a Zinc Ionophore. PLOS ONE 2014; 9(10): e109180. [DOI: 10.1371/journal. pone.0109180]
34. Sargsyan K, Chen T, Grauffel C, Lim C. Identifying COVID-19 Drug-Sites Susceptible To Clinically Safe Zn-ejector Drugs Using Evolutionary/
Physical Principles. Preprints 2020, 20200300`12 2020.
35. Steinbrenner H, Al-Quraishy S, Dkhil MA, Wunderlich F, Sies H. Dietary Selenium in Adjuvant Therapy of Viral and Bacterial Infections. Advances in Nutrition 2015; 6(1): 73-82. [DOI: 10.3945/an.114.007575]
36. Colunga Biancatelli RML, Berrill M, Marik PE. The antiviral properties of vitamin C. Expert Review of Anti-infective Therapy 2020; 18(2): 99-101. [DOI:10.1080/14787210.2020.1706483]
