Смисъл на броя: Роля на антинеутрофилцитоплазмените антитела (ANCA) в диагностиката на пулмореналния синдром

Използвани съкращения:

Анти GBM – антитела антитела срещу

гломерулобазалната мембрана

анти-RNP – антитела срещу рибонуклеопротеини

НТР  – неутрофили

AAV – ANCA асоциираните васкулити

ANA – анти-нуклеарни антитела

ANCA – анти-неутрофилцитоплазмени антитела

c-ANCA – цитоплазмена ANCA

p-ANCA – перинуклеарна или периядрена ANCA

BPI – протеин, повишаващ бактерицидната пропускливост

dsDNA – двойноверижна ДНК

ELISA – Ензимно свързаният имуносорбентен анализ

EGPA – Еозинофилна грануломатоза с полиангиит

GPA – Грануломатоза с полиангиит

IBD – Възпалителни заболявания на червата

IBS – Irritablebowel syndrome/синдром на раздразненото черво

IIF – индиректнаимунофлуоресценция

LAMP2 – протеин, свързан с лизозомен мембранен гликопротеин 2

MPA – Микроскопски полиангиит

MPO – миелопероксидазата

NETs – неутрофилни екстрацелуларни капани

PR3 – протеиназа 3

PRS – пулморенален синдром

Th – Т хелперни CD4+ лимфоцити

Пулмореналният синдром (PRS) е тежко, в някои случаи животозастрашаващо състояние, комбиниращо дифузна алвеоларна хеморагия и бързо прогресиращ гломерулонефрит. За първи път е описан от Goodpasture през 1919 г. и поради това в началото е наречен на негово име – „синдром на Goodpasture“¹. Впоследствие става ясно, че това са група от болести, имащи общи клинични и рентгенологични прояви, но различни имунопатогенетични механизми и автоантитела. Затова на база на клиничните симптоми се въвежда като термин „пулморенален синдром“². Най-често замесените заболявания в PRS са ANCA асоциираните васкулити (AAV) на малките съдове и синдрома на Goodpasture, свързан с антитела срещу гломерулобазалната мембрана (анти-GBM антитела)³. Разпределението на болестите в контекста на пулмореналния синдром е: приблизително 70% от случаите се падат на ААV, свързани с антитела срещу човешки неутрофили (ANCA). Синдромът на Goodpasture се свързва с около 20%, а васкулитите, медиирани от имунни комплекси, заемат останалите 10% от случаите. Интерес буди и фактът, че в зависимост от основната болест, водеща до изява на пулморенален синдром, се описват различни автоантитела, играещи ключова роля в диагностиката и имунопатогенезата (Табл. 1)⁴. PRS представлява плеяда от болести, в това число се включват и някои инфекции, като наскоро дори беше замесена и инфекцията със SARS-COV-2.

Табл. 1. Нозологични единици и съответните им автоантитела, свързани с изява на пулморенален синдром

Има научни съобщения за „двойно положително заболяване“, когато се откриват както анти-GBM, така и ANCA антитела. Клиничното значение на този феномен остава все още неизвестно, но се предполага, че ANCA-индуцираното гломерулно увреждане може да доведе до образуване на неоепитопи, които са мишена за секреция на анти-GBM антитела при тези пациенти^6,7. Средно около 14% от пациентите с положителни ANCA антитела имат и анти-GBM антитела, както и 30% от пациентите с анти-GBM антитела са ANCA положителни⁴ .

Пулмореналният синдром се асоциира с висока смъртност, затова е изключително важна бързата диагноза и последващата адекватна терапия. Относно имунологичните показатели с най-голяма тежест са антинеутрофилцитоплазмените антитела (ANCA) поради тяхното разнообразие, срещането им не само при ААV и комплексното им тълкуване. Разбирането на централната роля на ANCA е от решаващо значение за напредването на познанията за имунопатогенетичните механизми и разработване на целенасочени терапевтични стратегии в ерата на персонализираната медицина.

Неутрофилите (НТР) са най-многобройната клетъчна популация сред левкоцитите. Те са между 50 – 70% от белите клетки и принадлежат към неспецифичната имунна защита на организма, което им позволява да се активират минути след поява на „сигнал опасност“ и да задвижат процеси и механизми, свързани с елиминиране на причинителя на този сигнал^8,9. В продължение на много години НТР са се смятали за кратко живееща, хомогенна популация, която е първата линия на защита срещу патогени, включително бактерии, гъбички и протозои. Днес се знае, че те се различават фенотипно, разнородна популация са и участват в много патологични състояния като автоимунни заболявания, а също и в антитуморната защита¹⁰. Гранулите на НТР, чрез които осъществяват своята функция, най-общо могат да се разделят на 2 групи: пероксидаза-положителни гранули, наричани още азурофилни, и пероксидаза-отрицателни гранули. Основният протеин на пероксидазно-позитивните гранули е ензима миелопероксидазата (MPO), който катализира образуването на реактивни кислородни радикали по време на възпалителен процес, но също е и един от двата „главни“ антигени, срещу които са насочени ANCA. Азурофилни гранули съдържат и протеази, неутрофилна еластаза, катепсин Gи протеиназа 3 (PR3) – другият „главен“ антиген за ANCA¹¹.

НТР като клетки на вродения имунитет, освен че се активират бързо, в някои от случаите „жертват себе си“, образувайки т.нар. неутрофилни екстрацелуларни капани (NETs). Това са структури от влакна, съдържащи ДНК на НТР, части от цитоплазмата, включително и от азурофилните и пероксидаза отрицателните гранули. NETs представляват лепкава мрежа, която НТР хвърля извън себе си, за да се бори с нашествието на екстрацелуларните патогени, като разкъсва клетъчната си мембрана. Това води до унищожение на инфекциозния агент, но и на неутрофила – процес, известен като „самоубийствена НЕТоза“¹². Поради тази причина NETs участват активно и в имунопатогенезата на AAV, като стимулират автоимунния процес чрез представяне на ANCA антигени (MPO, PR3) на дендритните клетки за активиране на Т хелперните CD4+ лимфоцити (Th). Следва превръщането им в Th2CD4+ субпопулация, способна да активира автореактивни В лимфоцити за секреция на антитела (ANCA) срещу MPO, PR3. От своя страна, активираните Th2 клетки секретират и множество цитокини, които затварят порочния кръг, като водят до  непрестанно активиране на НТР, нови NETs и ендотелно увреждане^{13, 14}.

Антинеутрофилцитоплазмените антитела (ANCA) са семейство автоантитела, главно от клас IgG, които са насочени към антигени, открити в цитоплазмените гранули предимно на полиморфонуклеарните неутрофилни гранулоцити¹⁵. В някой случай се установяват и в гранулите на моноцити, и в цитоплазмата на ендотелните клетки. Разделят се условно на две групи с различно клинично значение и донякъде различен имунофлуоресцентен образ:

• „главни“ ANCA: насочени срещу двата ензима на неутрофилите PR3 и MPO и пряко свързани с трите вида ANCA васкулити.
• „второстепенни“ ANCA: насочени към катепсин G, лактоферин, еластаза, дефензин, α-енолаза, моезин, протеин, повишаващ бактерицидната пропускливост (BPI), свързан с лизозомен мембранен гликопротеин 2 (LAMP2), β-глюкоронидаза, азуроцидин и други, свързани главно с имунокомплексните заболявания.

Основният метод за доказване на ANCA, години наред застъпен като „златен стандарт“, е индиректната имунофлуоресценция (IIF). Това е метод, даващ възможност за разпознаване на много различни видове антинеутрофилцитоплазмени антитела, тъй като се извършва върху препарати, изготвени от човешки неутрофили.

Двете „главни“ ANCA срещу PR3 и MPO имат различни модели на клетъчна локализация при изследването им с IIF. Например антителата срещу PR3 се наблюдават като дифузно, едрогранулирано оцветяване на цитоплазмата на неутрофилите в ябълковозелена флуоресценция. Образът е известен като цитоплазмена ANCA (c-ANCA) (Фиг. 1а).

Фиг. 1. Видове ANCA установени чрез индиректна имунофлуоресценция. 1а –cANCA, 1б – pANCA, 1в – атипична рANCA

Антителата срещу МРО се визуализират като фино, подобно на пръстен оцветяване около ядрената мембрана на НТР и се означават като перинуклеарна или периядрена ANCA (p-ANCA) (Фиг. 1б).

Има и други имунофлуоресцентни образи като атипична ANCA или хANCA, които обикновено се асоциират с „второстепенни“ ANCA и не се свързват със системните васкулити на малките съдове (Фиг. 1в). В този случай антинеутрофил-цитоплазмените антитела са насочени срещу катепсин G, BPI, лактоферин, еластаза, дефензин, α-енолаза, моезин, азуроцидин, протеин, LAMP2 и други. Патогенността на тези „второстепенни“ ANCA обикновено се счита за ниска в сравнение с „главните“ ANCA и се асоциират различни видове инфекции, кистозна фиброза, автоимунни заболявания на черния дроб или възпалителни чревни заболявания (Табл. 2)¹⁴.

Табл. 2. Видове ANCA IIF – съответстващите антигени, срещу които са насочени и заболяванията, при които се срещат

Изследването на антителата срещу човешки НТР представлява комплексен подход, при който се изследват ANCA чрез индиректна имунофлуоресценция на етанол и/или формалин фиксирани неутрофили и тестване за анти-PR3 и анти-MPO антитела, чрез твърдофазов имуноанализ – Anchor ELISA. Има и т.нар. биочипове, които обединяват формалин и етанол фиксирани НТР, заедно с твърдофазов метод флуоресцетни дотове (точки) за установяване на антитела срещу PR3 и MPO, а в някои случаи и dsDNA (Фиг 2). Обикновено биочиповете се използват за потвърждение или отхвърляне на положителен резултат за ANCA, особено когато в пробата на даден пациент са намерени високи нива на ANA, включително анти-dsDNA, анти-RNP и други, които могат да дадат кръстосана реактивност върху субстрата от етанолфиксирани НТР.

Фиг. 2. ANCA IIF биочип: 2а – cANCA на етанолфиксирани неутрофили, 2б – cANCA на формалин фиксирани неутрофили, 3в – положителен дот за антитела срещу PR3.

Проблемът за атипичните pANCA обаче не може да бъде категорично решен поради позитивирането им в ниски титри при някои инфекции и прием на химични субстанции, които не дават драматичната картина на пулморенален синдром. Според международния консенсус от 1999 г. методът на избор за стандартен скрининг на ANCA е IIF с фиксация в етанол¹⁶. Предимството му е, че има висока чувствителност 84 %, 91% специфичности – може да даде ориентировъчна представа за „главните“ ANCA. В консенсуса се коментира, че допълнителното изследване на анти-PR3 и анти-MPO обогатява и прецизира получения резултат, като дава най-подробна и ясна представа за нозологичната единица, предизвикала клинични симптоми на пулморенален синдром¹⁶. Консенсусът обаче беше ревизиран през 2017 г. по отношение на диагностиката на AAV и сега се препоръчва да се стартира изследването с антитела срещу PR3 и MPO чрез ELISA за първичен скрининг и при положителен резултат или гранични стойности да се изследват ANCA чрез имунофлуоресценция¹⁷.

В заключение, значението на ANCA за диагностиката на пулмореналния синдром е голямо, но определено представлява предизвикателство поради възможността за фалшиво отрицателни или положителни резултати при недобро познаване на имунофлуоресцентния метод от дадения специалист. От друга страна, изследването само на антитела срещу протеиназа 3 и миелопероксидаза ограничава възможността за установяване на останалите болести с положителни ANCA.

Послания за  клиничната практика

Когато говорим за заболяване, в хода на което се подозира  развитие PRS, трябва да се изследва панел от автоантитела, включващ: ANCA IIF, анти-PR3,  анти-MPO, анти-GBM, криоглобулини, ANA IIF и антифосфолипидни антитела. Впоследствие, ако ANA са положителни във високи титри над 1:1280 и имат специфичен АС код, според международния консенсус за ANA сведения (ICAP) е препоръчително да се разгърне конкретния панел от автоантитела, отговарящ на имунофлуоресцентния образ.

Литература:

1. Goodpasture EW. Thesignificanceofcertainpulmonarylesionsinrelationtotheetiologyofinfluenza. Am J MedSci 1919; 158: 863. doi: 10.1097/00000441-191911000-00012.
2. Gallagher H, Kwan JT, Jayne DR. Pulmonaryrenalsyndrome: a 4-year, single-centerexperience. Am J KidneyDis 2002; 39: 42–47.
3. Boyle N,O‘Callaghan M,Ataya A, et al.Pulmonaryrenalsyndrome: a clinicalreview.Breathe (Sheff)2022;18(4):220208. doi:10.1183/20734735.0208-2022
4. West SC, Arulkumaran N, Ind PW, etal. Pulmonary-renalsyndrome: a lifethreateningbuttreatablecondition. PostgradMed J 2013; 89: 274-283.
5. Martin K,Deleveaux S,Cunningham M, et al. The presentation, etiologies,pathophysiology, and treatment of pulmonary renal syndrome: A review of the literature. Disease-a-Month, 2022; 68 (12): 101465, https://doi.org/10.1016/j.disamonth.2022.101465
6. Philip R, Dumont A, MartinSilva N, etal. ANCA andanti-glomerularbasementmembranedouble-positivepatients: a systematicreviewoftheliterature. AutoimmunRev 2021; 20: 102885.
7. McAdoo SP, Pusey CD. Anti-glomerularbasementmembranedisease. Clin J AmSocNephrol 2017; 12:1162–1172.
8. Liew PX, Kubes P. TheNeutrophil’sRoleDuring Health andDisease.Physiol. Rev.2019;99:1223–1248. doi:10.1152/physrev.00012.2018.
9. Coffelt SB, Wellenstein MD, deVisser KE. Neutrophilsincancer: Neutralnomore.Nat. Rev. Cancer.2016;16:431–446. doi:10.1038/nrc.2016.52.
10. Silvestre-Roig C, Fridlender ZG, Glogauer M, Scapini P. Neutrophil Diversity in Health and Disease.Trends Immunol. 2019;40(7):565-583. doi:10.1016/j.it.2019.04.012
11. Cowland JB, Borregaard N. Granulopoiesisandgranulesofhumanneutrophils.Immunol. Rev.2016;273:11–28. doi:10.1111/imr.12440.
12. Hang Y,Biermann MH; Brauner JM,Liu, YZ, et al.“New InsightsintoNeutrophilExtracellularTraps: MechanismsofFormationandRoleinInflammation“. FrontiersinImmunology. 2016; 7: 302. doi:10.3389/fimmu.2016.00302. ISSN 1664-3224. PMC 4981595. PMID 27570525.
13. d’Alessandro M, Conticini E, Bergantini L, et al.NeutrophilExtracellularTrapsin ANCA-Associated VasculitisandInterstitialLungDisease: A ScopingReview.Life.2022;12:317. doi:10.3390/life12020317.
14. Walulik A, Łysak K, Błaszkiewicz M, et al. TheRoleofNeutrophilsin ANCA-Associated Vasculitis: ThePathogenicRoleandDiagnosticUtilityofAutoantibodies. Int J MolSci. 2023 Dec 7;24(24):17217. doi: 10.3390/ijms242417217.
15. Wallace ZS, Miloslavsky EM. Managementof ANCA associatedvasculitis. BMJ. 2020;368:m421. doi: 10.1136/bmj.m421.
16. Savige J, Gillis D, Benson E, etal. International ConsensusStatementonTestingandReportingofAntineutrophilCytoplasmicAntibodies (ANCA)Am. J. Clin.Pathol.1999;111:507–513. doi:10.1093/ajcp/111.4.507.
17. Bossuyt X, Tervaert JWC, Arimura Y, etal. Revised 2017 internationalconsensusontestingofANCAsingranulomatosiswithpolyangiitisandmicroscopicpolyangiitis.Nat. Rev. Rheumatol.2017;13:683–692. doi:10.1038/nrrheum.2017.140.