Имунологични параметри при интерстициална белодробна болест и прогресивна белодробна фиброза

Използвани съкращения

ИББ – интерстициална белодробна болест

ПБФ – прогресивна белодробна фиброза

СБСТ – системни болести на съединителната тъкан

Автоимуните болести засягат между 5 и 8% от населението на света, като особено голяма е тяхната честота в развитите индустриализирани страни с висок жизнен стандарт, сред които принадлежи и България. Макар и донякъде условно, тази група болести може да бъде разделена на орган-специфични болести и системни болести на съединителната тъкан (СБСТ).

СБСТ поразяват множество органи и структури в организма, като основен патогенетичен момент се явява хроничното възпаление на кръвоносните съдове и съединителнотъканните елементи¹. Именно поради голямата си площ и изобилие на съдове и съединителна тъкан, белите дробовесе явяват една от най-опасните и значими мишени на автоимунния процес в хода на СБСТ. Пораженията на белите дробове при СБСТ могат да бъдат разнообразни, но особено характерна е картината на интерстициална белодробна болест (ИББ) и съответно на прогресивна белодробна фиброза (ПБФ). Автоимунните процеси, водещи до развитие на тези болести, ще бъдат разгледани в контекста на тяхната имунопатогенеза и в контекста на мястото им в диагностичния процес.

Имунопатогенеза на ИББ при СБСТ

Както е известно, ИББ е хетерогенна група от болести, свързани със засягане на алвеоларните епителни клетки, пулмоналните капиляри, ендотелните клетки, базалните мембрани, периваскуларните структури и локалните лимфоидни тъкани. Развитието на автоимунния процес, водещ до ИББ, е сложен и многостъпален път, който включва генетична предизпозиция, епигенетични събития и влияние на фактори на средата. На тази база се развиват автоимунни феномени, в който участват фактори на вродения и продобития имунитет².

Много са генетичните фактори, асоциирани с развитие на ИББ и ПБФ. Важно място от тях заемат мутациите в гени, контролиращи теломеразната активност на левкоцитите като TERT, TERC, PARN, RTEL1. Наред с това силна асоциация се наблюдава с промени в гени, кодиращи структури, отговорни за целиарния клирънс като промоторния вариант rs35705950 на MUC5B, водещ до свръхекспресия на MUC5B. Този вариант се наблюдава при 2/3 от пациентите с ПБФ и обуславя 30 – 35% риск от развитието на заболяването. Определени алели от HLA  системата като DRB1*15:01 и DQB1*06:02, както и алели, свързани с фактори, регулиращи системата на интерфероните тип 1 (IRF-5), също се асоциират с развитие на ИББ и ПБФ. Сред епигенетичните събития от важно значение се явяват промените в ДНК метилацията, комбинирани с определени генни експресии. Например хиперметилация на ДНК, комбинирана с експресия на ZNF467 и CLDN5, се явява фактор, понижаващ риска от развитие на ПБФ, докато хипометилация на ДНК, комбинирана с експресия на TP53INP1 и DDAHI, се явява фактор, увеличаващ риска от развитие на ПБФ. От епигенетичните фактори основна роля имат и промените на някои микро-РНК-и, като let-7, mir-29, mir-30, mir-155, mir-21. Важен момент също така са хистоновите модификации, свързани с ендотел-мезенхимно преминаване, промени в процеса на апоптоза и действията на простангландин Е2. Генетичните и епигенетичните фактори се явяват основа за развитие на автоимунен процес, но факторите на средата са събитието, което „натиска спусъка“. По отношение на развитието на ИББ и ПБФ важна роля има гастроинтестиналния рефлукс, често асоцииран с наличие на Helicobacter pylori. В приблизително 94% от пациентите с ИББ се описва гастроинтестинален рефлукс. Наред с това важен фактор на средата са респираторните вируси, от които основно значение се отдава на вируса на Епщайн-Бар. Ролята на тютюнопушенето не е катогорично доказана, но е предполагаема на базата на известните данни, свързани с действието на съставки на тютюневия дим в биохимичните промени на пептидите и привличането на клетки на имунната система. Като фактор на средата, способен да отключи развитие на автоимунен процес при ИББ, се коментират и множество лекарствени средства. Повече от 600 лекарства влияят върху белия дроб, като с най-голямо значение са: златни соли, такролимус, метотрексат, TNFα- блокери, анти-CD20 и т.н. Както се вижда, голяма част от тези лекарства се прилагат за лечение на ревматични болести, поради което се коментира възможно развитие на ИББ, индуцирана от антиревматични медикаменти (anti-rheumatic drug induced ILD) ².

Автоимунната природа на ИББ и ПБФ се демонстрира с активирани локално Toll-like рецептори (TLR2 и TLR-9), наличието на В клетъчна инфилтрация и инфилтрация от Т-хелпери (Th) и макрофаги, като последните два вида клетки секретират цитокини, които са свързани с т.нар. „Th2 имунен отговор“, основна характеристика на който е секрецията на антитела. В конкретния случай става въпрос за автоантитела, насочени срещу собствени структури, които по правило са интрацелуларно разположени и нормално недостъпни за действието на имунната система.

В хода на процесите на клетъчна смърт тези интрацелуларни структури се появяват на клетъчната повърхност или се секретират от клетката, като впоследствие се отлагат в тъканите. Излезлите извънклетъчно структури се наричат скрити (cryptic) антигени или екстернализирани интрацелуларни антигени (ЕИА). Както стана ясно, тяхното образуване е нормален процес, който се осъществява при някои форми на клетъчна смърт, предимно апоптоза. Нормално апоптотичните клетки излъчват сигнали, обобщени като “find me” („намери ме“), които привличат макрофагите. Последват “еat me” („изяж ме“) – сигнали, представляващи поява на молекули върху клетъчната мембрана, които могат да бъдат разпознати от фагоцитиращите клетки.

Финалният етап на ефективното очистване е поглъщането на ЕИА, съпроводено от “tolerate me” („толерирай ме“) – сигнал, осъществяващ се чрез секреция от макрофагите на цитокините IL-10 и TGFβ, които потискат образуването и действието на проинфламаторни цитокини. Така осъществената фагоцитоза и „изчистване“ на ЕИА протича в процес, дефиниран като „имунологична тишина“ – с други думи, липса на секреция на провъзпалителни стимули и съответно липса на възпаление^3,4. При прекомерна интензивност на процеса на клетъчна смърт и/или дефекти в него, както и при дефицит на молекули, ангажирани в процеса на „очистване“ чрез фагоцитоза, ЕИА могат да имат и алтернативна съдба. Липсата на бърза и ефективна фагоцитоза води до персистирането на ЕИА и част от тях претърпяват процес, известен като „вторична некроза“, както и множество модификации като фосфорилация, дефосфорилация, ацетилиране и цитрулиниране, което ги определя като неоантигени. Бидейки неоантигени, ЕИА не се изчистват от макрофагите, а се разпознават и поглъщат от незрелите дендритни клетки, които съзряват, превръщат се в зрели дендритни клетки, имащи всички необходими костимулаторни молекули за ефективно антигенно представяне. Дендритните клетки навлизат в лимфните възли, където представят епитопи от ЕИА на Т лимфоцитите, което от своя страна води до тяхната антиген-специфична активация. Така активираните Т лимфоцити комуникират с автореактивни В клетки, които впоследствие се диференцират в плазматични клетки, секретиращи автоантитела срещу EИА⁵. От съществено значение се явява фактът, че дефектите при процеса на апоптоза водят до формиране на т.нар. damage associated molecular patterns (DAMPs, молекулярни структури, свързани с клетъчна увреда). В миналото DAMPs са известни още като „сигнали за опасност“ (danger signals) и именно под тяхно действие дендритните клетки съзряват, имунният отговор променя своя „клас“ и се трансформира в автоимунен^6-8.

Три феномена допринасят за реалното пречупване на имунологичния толеранс и развитието на автоимунен процес. Първо, автоимунният отговор срещу неоантигените на ЕИА прераства в автоимунен отговор срещу други собствени структури, които са епитопно подобни на ЕИА – процес, известен като „epitope spreading“. Второ, под действието на ЕИА се секретира фактор, известен като B lymphocyte stimulator (BLys), който засилва преживяемостта на автореактивните В клетки и съответно способността им да секретират автоантитела. В-лимфоцитите имат и антиген-представяща функция, която в хода на пречупването на имунологичния толеранс и хронифицирането на автоимунния процес става все по-важна. Така при стартирането на автоимунната реакция дендритните клетки представят епитопи от ЕИА на Т клетките, но постепенно се заместват от В лимфоцитите, които имат двойнствена функция – на антиген-представящи клетки и на източник на автоантитела. Трето, при развитие на автоимунния процес почти винаги се наблюдават дефекти в клетките и механизмите, служещи за „спирачки“ на имунната система⁵.

Съществува известно неразбиране по отношение на начините, чрез които автоантителата увреждат атакуваните структури. В конкретния случай, свързан с развитието на ИББ и ПБФ, имунопатогенетичното действие на автоантителата се свързва със способността им да разпознават своите автоантигени и да образуват имунни комплекси. Опитите за тяхното „изчистване“ водят до това, че макрофагите  захващат с Fc-рецепторите си имунните комплекси и ги поглъщат. Този тип поглъщане обаче се свързва със секрецията на множество проинфламаторни цитокини от страна на макрофагите. Така се стига до пряко увреждане на тъканите и привличане на други клетки на възпалението. Формира се възпалителен процес, интензивна клетъчна смърт, надхвърляща способността за „очистване“ на материите, формиране на неоантигени, имунен отговор срещу тях и порочен кръг.

Друго действие на автоантителата води до това, че връзката с техните автоантигени активира комплементната каскада по класически път, което води до цитолитично действие на комплемента, клетъчна увреда и привличане на възпалителни клетки⁹.

Автоантитела и ролята им в диагностичния процес при ИББ и ПБФ, асоциирани със СБСТ 

Както става ясно, при СБСТ някои автоантитела вземат участие в имунопатогенезата на болестта и в частност в имунопатогенезата на ИББ. Наред с тази им роля, автоантителата са ключов фактор в диагностиката, защото до голяма част корелират с възможността за развитие на ИББ и ПБФ, както и с потенциалната им тежест. Най-честите нозологични единици в рамките на СБСТ, при които има автоантитела, асоциирани с ИББ и ПБФ, са: автоимунните инфламаторни миопатии (миозити), системната склероза, ревматоидният артрит и ANCA-асоциираните васкулити. Тук ще бъде представен имунологичният поглед в диагностиката на автоантителата, тъй като ревматологичният беше представен в предишна публикация в INSPIRO (Пенев, бр. 4(67) 2022).

Според някои автори при съмнения за развитие на ПБФ следва да се обърне внимание на три домена: клиничен, морфологичен и имунологичен¹⁰. Автоантителата и тяхното определянe принадлежат именно към последния. В алгоритъма на изследване на автоантитела централно място заема изследването на антинуклеарните автоантитела (ANA). Важно е да се отбележи, че методологично изследването трябва да се извърши чрез индиректна имунофлуоресценция, за да се определи както титър на антителата, така и характерният образ на флуоресценция. ANA не е тип антитяло, а хетерогенна група, която включва повече от 200 автоантитела, насочени срещу различни структури на клетъчното ядро. Различните типове ANA корелират различно с възможно развитие на ИББ и дават различен флуоресцентен образ. В последните години изключително сериозно развитие има т.нар. International Consensus of ANA Patterns (ICAP). Целта на ICAP e установяването на характерни ANA образи (определяни с кодове AC-0 до AC-29) и съотнасянето им към определени автоантитела от спектъра на ANA. В системата ICAP са включени по-малко от 20 страни (включително и България), но тя бързо печели популярност сред имунолозите¹¹. Според повечето изследователи наличието на ANA в титър над 1:320 и образи от типа AC-4, AC-5 и AC-29, както и всеки ANA титър, придружен от образи тип AC-8, AC-9 и AC-10, са сериозни сигнали за възможно развитие на ИББ. Както се вижда от фиг. 1 и табл. 1, AC-8, AC-9 и AC-10 са образи, които най-често се свързват с наличието на автоантитела срещу PM-Scl -75, PM-Scl-100 и  Th/To, като и трите вида антитела имат силна корелация с потенциално развитие на ИББ (фиг.1А, табл.1). Съответно имуннофлуоресцентният образ AC-4 може да се дължи на автоантитела срещу Ku (фиг. 1Б, табл. 1), AC-29 е типичния образ на антитела срещу Scl-70 (фиг. 1В, табл. 1), a AC-5 може да е проява на антитела срещу U₁RNP (фиг. 1Г, табл. 1).

Фиг. 1. Имунофлуоресцентни образи на някои автоантитела, асоциирани с ИББ:

А. Нуклеоларен образ (AC-8), често асоцииран с автоантитела срещу PM-Scl 75, PM-Scl 100 и Th/To

Б. Фино петнист образ (AC-4), често асоцииран с автоантитела срещу Ku

B. AC-29, често асоцииран с автоантитела срещу Scl-70

Г. Едро петнист образ (AC-5), често асоцииран с автоантитела срещу U₁RNP

Д. Цитоплазмен образ AC-20, често асоцииран с автоантитела срещу Jo-1

Е. Цитоплазмен образ AC-19, често асоцииран с автоантитела  срещу PL-7 и PL-12

Наред с различните видове ANA, в имунологичната диагностика от съществено значение е определянето на автоантитела, които са насочени срещу цитоплазмени структури и които силно корелират с развитието на ИББ и съответно ПБФ. На първо място, това е групата на антисинтетазните автоантитела (aнти:  Jo1, PL-7, PL-12, OJ, EJ, KS, Zo, Ha), които при изследване на индиректна имунофлуоресценция дават цитоплазмени образи светене (фиг. 1 Д, Е, табл. 1). Според някои данни анти-синтетазните автоантитела са предиктивни за ИББ и корелират по-силно с ИББ, отколкото с автоимунните миозити, за които те са специфични^12,13. Друго важно автоантитяло, наличието на което в много голяма степен се асоциира с развитие на ИББ, е анти- MDA-5 (табл. 1) и според една класификация то попада в категорията „висок риск“ от развитие на ИББ. Съответно антисинтетазните антитела са в категория „среден риск“, докато в категория „нисък риск“ са други миозит-специфични автоантитела като анти-Mi-2, SRP, TIF-1γ¹².

При антитела, най-често свързани с развитието на ревматоиден артрит (ревма-фактори и антитела, насочени срещу цитролинирани пептиди – анти-CCP, anti-MCV), също могат да се установят корелации с развитие на ИББ¹² (таб. 1).

Tабл.1. Имунофлуоресцентен образ на някои автоантитела, асоциирани с ИББ

Антинеутрофилно-цитоплазмените автоантитела (ANCA), насочени най-често срещу неутрофилната миелопроксидаза (MPO) и протеиназа 3 (Pr3), също могат да бъдат част от спектъра на автоантителата, асоциирани с развитието на ИББ и ПБФ¹³.

При някои автоантитела асоцииациите им с ИББ и ПБФ все още са доста неясни. Такъв е случая с анти-SSa/Ro60 и анти-Ro52,  като за последното е известно, че често корелира с развитие на ИББ в комбинация с други автоантитела (напр. анти-Jo-1)¹⁰.

Като методологически подходи за имунологична диагностика на автоантитела, наличието на които се асоциира с развитие на ИББ и ПБФ, се използват индиректна имунофлуоресценция, ELISA-методи и имуноблот методи. Индиректната имунофлуоресценция е „златен стандарт“ за диагностика на ANA, като от съществено значение е и определяне на образите по ICAP системата. Често като „недостатък“ на този метод се сочи абсолютната необходимост от опитни и подготвени имунолози (лекари и биолози), които да интерпретират титъра и образите. След извършването на индиректната имунофлуоресценция, която е скрининг метод, даващ ориентация, следва да се извършат и тестове чрез другите споменати методологични подходи. Особено удобен се явява имуноблот теста, който позволява едновременното изследване на много автоантитела (фиг. 2).

Фиг. 2. Имуноблот тестове, определящи автоантитела при СБСТ:

А. Тест за диагностика на автоимунни миозити, позитивират се асоциираните с ИББ анти-Кu и анти-PL-12

Б. Тест за диагностика на системна склероза, позитивира се асоциираното с ИББ анти-Scl-70

Един съществен въпрос, който остава някак встрани, е ролята на имунологичната диагностика в определяне на автоантитела, асоциирани с ИББ и ПБФ като форма на ранна предикция за развитието на заболяването. Добре установен факт е, че в хода на автоимунния процес автоантителата могат да се установят месеци и години преди първите клинични прояви на СБСТ. Предиктивната роля за развитието на симптоми, свързани със СБСТ и с евентуалното развитие на ИББ и ПБФ за някои автоантитела, е показана на табл. 2.

Табл. 2. Автоантитела, асоциирани с ИББ, и времето за тяхната поява преди клиничната проява на системната автоимунна болест.

Послания към клиничната практика

Имунологичните параметри при ИББ и ПБФ имат съществено значение в два аспекта. От една страна, механизмите, отговорни за автоимунно обусловения процес, са тясно свързани с патогенезата на болестта. От друга страна, определянето на автоантитела, асоциирани с ИББ и ПБФ, дава основание да се счита, че съответната системна болест в хода на своето развитие може да има тежки последствия.

Литература

1. Shoenfeld Y, Youinou P, Gershwin ME. Geoepidemiology and autoimmunity. In The environment, geoepidemiology and autoimmune diseasaes. Elsevier, USA, 2010, j153-j167
2. Shao, T, Shi X, Yang Sh. et al.  Interstitial lung disease in connective tissue disease: a common lesion with heterogeneopus mechanisms and treatment consideration. Front immunol 2021 12:684699. doi:10.3389/fimmu2021. 684699
3. Gonzalez N and Hidalgo A. Nuclear receptors and clearance of apoptotic cells: stimulating the macrophage’s appetite. Front immunol 2014, 5:article 11
4. Szondy Z, Sarang Z, Kiss B et al. Anti-inflamtory mechanisms triggered by apoptotic cells during their clearance. Front immunol 2017, 8: article 909
5. Theofilopoulos A, Kono Dand Baccala R. The multiple pathways to autoimmunity. Nat Immunol. 2017:18(7) 716-724
6. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self. Science 2002, 296:301-306
7. Matzinger P.The evolution of danger theory. Exper Rev Clin Immunol, 2012, 8(4): 311-317
8. Matzinger P. Autoimmunity: Are we ask the right question? Front immunol 2022, 13:864633. doi:10.3389/fimmu.2022.864633
9. Ludwig R, Vanhoorelbeke K, Leypoldt F. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Front immunol 2017 8:603. doi:10.3389/fimmu.2017.00603
10. Kuwana M, Gil-Vila A and Selva-O’Callaghan. Role of autoantibodies in diagnosis and prognosis of interstitial lung disease in autoimmune rheumatic disorders. Ther Adv Musculoskel  Dis 2021, 13:1-17
11. Кюркчиев Д, Иванова-Тодорова Е, Тумангелова- Юзеир К, Куртева Е, Василев Г. Имунофлуоресцентно определяне на АНА –„Златният стандарт” Под редакцията на Екатерина Иванова-Тодорова, 2018. Централна медицинска библиотека – Медицински университет – София,  ISBN 978-954-9318-91-3
12. Yoshifuci H. Biomarkers and autoantibodies of intersticial lung disease with idiopathic inflammatory myopathies. In: Clinical Medicine insignts: circulatory, respiratori and pulmonary medicine 2015, 9:141-146
13. Conrad K, Schobler W, Hiepe F, Fritzler M. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases. Pabst Science publishers, Dresden, 2015
14. Eriksson C., Kokkonen H., Johansson M. et al. Autoantibodies predate the onset of systemic lupus erythematosus in northern Sweden. Arthritis research&Therapy 2011; 13: R30.
15. Harel M. and Shoenfeld Y. Predicting and preventing autoimmunity, myth or reality. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006; 1069:322-345.
16. Bizzaro N., Tozzoli R. and Shoenfeld Y. Are we at the stage to predict autoimmune rheumatic diseases? ARTHRITIS & RHEUMATISM 2007; 56(6):1736-1744.