Имунодиагностика на латентната туберкулозна инфекция – характеристика, възможности и предимства на новите IFN-γ−базирани тестове

”Елиминирането на туберкулозата зависи от своевременната диагностика и лечение на латентната туберкулозна инфекция, най-важното условие за предотвратяване развитието на болестта”.

Peter Barnes, 2004, AJRCCМ.

Туберкулозата представлява първостепенно по важността си предизвикателство пред общественото здравеопазване. До неотдавна считана за проблем, останал в миналото, днес тя се завръща и независимо от постигнатите успехи в диагностиката, имунопрофилактиката и лечението, остава една от най-широко разпространените инфекции. Според СЗО¹, болестта се разпространява изключително бързо и убива повече млади и възрастни хора, от което и да е друго инфекциозно заболяване. Всяка година в света се регистрират около 8 милиона новозаразени и около два милиона смъртни случаи. Проблемът с контрола над разпространението на туберкулозната инфекция е изключително актуален, пред вид бързо развиващата се антибиотична резистентност, с поява на мулти (MDR) и свръх-резистентни (XDR) форми на МТВ. „Принос” към тази неблагоприятна ситуация през последните две десетилетия у нас има и развитието на HIV инфекцията. Съществен е фактът, че туберкулозната инфекция е най-голямата опортюнистична инфекция сред заразените с HIV, като при ко-инфектираните индивиди рискът от реактивиране на латентната туберкулоза се увеличава многократно. Контролът над туберкулозата изисква многостранен подход и интегриране на ефективни мерки на общественото здравеопазване, прилагане на нови диагностични методи, нови медикаменти и ваксини.

Латентна туберкулозна инфекция

ЛТБИ се дефинира като безсимптомно състояние при лица, инфектирани с M. tuberculosis, при които няма клинични, микробиологични или рентгенологични данни в подкрепа на активно туберкулозно заболяване. Диагнозата се поставя по наличието на специфичен имунен отговор към МТВ^2-4.

Началото на туберкулозната инфекция се поставя след достигането на микобактериите до белодробните алвеоли, където те навлизат и се реплицират в ендозомите на алвеоларните макрофаги. Неутрофилните гранулоцити се струпват рано в участъка на инфекция, но са неспособни да убиват директно MTB. Загиващите неутрофили и макрофаги изхвърлят обвивките си, съдържащи антигени на M. tuberculosis или интактни микобактерии, които биват прихващани от алвеоларните дендритни клетки. Те от своя страна мигрират към регионалните лимфни възли, където антигените на M. tuberculosis биват представени на Т лимфоцитите². В лимфните възли стимулираните CD4+ и CD8+ T клетки се диференцират съответно в (1) интерферон (IFN)‑γ секретиращи T‑ хелперни (Th) тип 1 клетки или (2) цитотоксични Tc1 клетки, които акумулират в своите гранули молекулите Гранзим и Гранулизин⁵. МТВ‑специфичните ефекторни Т клетки навлизат в кръвообращението и достигат до участъците на възпаление, като белия дроб.

След контакт с болен от туберкулоза и инхалиране на M. tuberculosis, повече от 50% от експонираните лица с добре функциониращ вроден и придобит имунитет могат да останат неинфектирани. Те са с отрицателен Манту и IFN-γ тест. При останалите експонирани лица се наблюдава конверсия както на Манту, така и на IFN-γ теста. Около 5% от тях, с потиснат имунитет, бързо прогресират и развиват активна туберкулозна болест. Останалите 95%, при които имунната система функционира добре, държат под контрол M. tuberculosis в грануломатозни лезии. Там патогенът персистира в „спящо“, „дремещо“ състояние за много дълъг период от време. Инфектираните лица са с положителен Манту и IFN-γ тест и се определят като лица с латентна туберкулозна инфекция (ЛТБИ). Рискът от реактивиране на латентната туберкулоза при имунокомпетентни индивиди е в порядъка на 2 до 5%, но само в случаите, когато са подложени на имуносупресия^6,7.

Клетъчно-медиираният имунитет е главният компонент на защита на организма срещу МТВ. При резистентни индивиди контролът върху МТВ инфекцията се осъществява от развитието на Th1тип имунен отговор, в който участват алвеоларни макрофаги, дендритни клетки, Т лимфоцити (CD4+, CD8+,γβ-T лимфоцити, NK клетки, двойно-негативни (DN) CD4+ и CD8+ T клетки, Th17 клетки) и продуцираните от тях медиатори, като проинфламаторните цитокини IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18, TNF-α, и хемокините IL-8, MCP-1,  MIP-1. Всички те играят важна роля в привличането на допълнителни клетъчни популации в мястото на инфекцията и в образуването на гранулом, който държи под контрол туберкулозните бактерии и осигурява така необходимата дълговременна ниша за ЛТБ^8-10 (Фиг. 1).

Фиг. 1. Спектър на туберкулозната инфекция, жизнен цикъл на Mycobacterium tuberculosis, имунопатогенеза на белодробната туберкулоза/8/

След инхалиране на МТВ (1); при около 50% от случаите, инфекцията може да се изчисти (2); с помощта на добре действащите механизми на вродения и адаптивния имунитет, като тези лица са с отрицателни имунодиагностични тестове. При останалите експонирани лица се наблюдава конверсия на Манту и IGRA тестовете (3); лицата с добре функционираща имунна система успяват да държат под контрол МТВ в грануломатозни лезии и се определят като лица, латентно инфектирани с МТВ (4); малък процент (2-5%) от тях, само ако са подложени на имуносупресия, могат да прогресират до активна туберкулоза (5); някои индивиди с положителни имунодиагностични тестове могат след преходен период на позитивност да се негативират (6); а има лица, които при съответните обстоятелства могат да се реинфектират (7). Грануломът е сктруктурната организация на различни видове имунни клетки: макрофаги, T и B клетки, дендритни клетки, неутрофили, NK клетки и фибробласти, и се формира в отговор на белодробното възпаление, в резултат на стимулиращото действие на микобактериалните антигени^9,11.Грануломът се инициира от резидентните макрофаги, които фагоцитират бактериите и освобождат проинфламаторни цитокини. Макрофагите са едни от най-важните клетки, които вземат участие във формирането на гранулома. Грануломът е морфологичен израз на опита на клетките на имунната система да ограничат и спрат разпространението на микобактериалната инфекция. Същевременно, формирането му показва, че инфекциозният агент не може да бъде напълно унищожен. В огнището на инфекцията макрофагите се превръщат в епителоидни клетки, които са с по-големи възможности да локализират МТВ и да не допуснат разпространението му в организма. Макрофагите са “изходният материал” за образуване на т.н. гигантски многоядрени клeтки, тип Лангханс, срещащи се в туберкуломите, и имащи способността да унищожават вътреклетъчно локализираните микобактерии ^12-14. Счита се, че те възникват при сливането на няколко епителоидни клетки или, че произлизат от макрофаг, в който се дели само ядрото без разделяне на цитоплазмата. В класическия вариант грануломът се състои от централна казеозна некроза (понякога и с калцификати, говорещи за хроничния характер на процеса), около която са разположени Лангхансови и епителоидни клетки, с лимфоцитен вал около тях, включващ CD4+ T клетки, които могат да усилят бактерицидния капацитет на макрофагите чрез продуцирания от тях IFN-g¹⁴. С имунофлуоресцентни методи е установено, че лимфоцитите са от различни фенотипове: 30-60% са специфични CD4+ Т лимфоцити, а съотношението CD4+/CD8+ Т лимфоцити, е приблизително 1:1. Срещат се и γ/β-Т лимфоцити, както и CD1-рестриктирани NKT-клетки^12,13,16. При по-напреднали стадии на активна МТВ инфекция в периферията на гранулома се наблюдава струпване на неутрофили и еозинофили ^17-20(Фиг. 2).

Фиг. 2. Съществуват няколко грануломни типа: а) Класическият туберкулозен гранулом, който се установява при активна болест и при латентна инфекция, е казеозният гранулом, който е изграден от епителни макрофаги, неутрофили, вал от лимфоцити (CD4⁺ и CD8⁺ T клетки и B клетки) и понякога е ограден от периферна фиброза. Центърът на този гранулом е казеозен, в некротично състояние, което се състои от мъртви макрофаги и други клетки. Тази зона е хипоксична. Микобактериите в този гранулом са локализирани в макрофагите (могат да бъдат и в контакт с Т клетките) в хипоксичния център или в зоната на фиброза. b) Не-некротизиращият гранулом се състои първоначално от макрофаги и лимфоцити, а M. tuberculosis е разположен в макрофагите. c) Фибротичните лезии са по-характерни за латентната туберкулозна инфекция, но се установяват и при активна болест. Композирани са предимно от фибробласти и от минимален брой макрофаги.

Силата на клетъчно-медиирания имунен отговор и правилно формираният гранулом определят изхода на МТВ инфекцията

При около 90% от инфектираните с МТВ имунният отговор е достатъчно силен, за да предотврати развитието на туберкулозна болест^6,7. Ефекторните протеини и гликолипиди на МТВ причиняват промени както в бактериалния метаболизъм, така и в метаболизма на инфектирания индивид, като по този начин повлияват персистирането на туберкулозните бактерии в гранулома^21,22. В гранулома персистиращите бактерии са подложени на различни стресови ситуации като хипоксия, недостиг на хранителни вещества, кисело pH и потискане на дишането от азотен оксид. Всички тези фактори индуцират експресията на гени, които водят до трансформиране на МТВ от активно в пасивно, дремещо състояние¹¹. “Спящите” бактерии са в състояние да сведат до минимум своята метаболитна и рипликативна активност, както и да инхибират растежа и развитието си. Те стават резистентни и избягват имунните атаки²³. След години или десетилетия на латентност, туберкулозните бактерии могат отново да променят своя метаболизъм, да се реактивират и повлияят гранулома,  което води до некроза и клетъчна смърт²². Предполага се, че правилното формиране на гранулома е от решаващо значение за ограничаване на бактериалния растеж, тъканното увреждане и дисеминирането на процеса²⁴. Интензитетът и качеството на Т-клетъчния отговор в гранулома зависи от механизмите, таргетиращи презентацията на антигена. В този процес важно значение имат някои компоненти на МТВ, като 19-kDa lipoprotein, Man-LAM и cord-factor, които могат да модулират неблагоприятно обработката и представянето на микобактериалните антигени. По този начин, туберкулозните бактерии затрудняват макрофагите при  презентиране на антигена на Т лимфоцитите²⁵. Недостатъчната активация на ефекторните CD4+, CD8+ и g/dT лимфоцити, CD1- рестриктираните и цитотоксичните T клетки резултира в дефектни микробицидни функции и модифицирана активност на други имунни клетки, участващи във възпалителните отговори, които водят до тъканно увреждане и дисеминиране^24,25.

Лицата с ЛТБИ могат да развият активна туберкулоза в зависимост от състоянието на имунния си статус. Счита се, че през целия живот на инфектираните рискът от развитие на туберкулозна болест е около 2-5%, като около половината от тях прогресират още в първите пет години¹⁰. Рисковите фактори, благоприятстващи реактивацията на туберкулозата, включват: HIV/СПИН, диабет, силикоза, автоимунни заболявания, злокачествени тумори, ХБН, трансплантация, имуносупресивна терапия (кортикостероиди, анти-TNF-a терапия, анти-туморна терапия), тютюнопушене, алкохолизъм, наркозависимости, недохранване^7,11. Разбира се, в повечето случаи специфичната причина за реактивация е неизвестна²⁶.

Имунодиагностика на М. Tuberculosis – определяне на MTB-специфичен имунен отговор

Диагностичните възможности при активна туберкулоза са повече отколкото тези при ЛТБИ, където всъщност те са само две: добре познатият туберкулинов вътрекожен тест, тип Манту, и неотдавна появилите се IFN-g-базирани тестове.

В резултат на огромните постижения в микробиологичната диагностика на активната туберкулоза, както и в имунодиагностиката на МTB инфекцията през последните години, клиницистите вече разполагат с нов инструментариум за най-добро класифициране на индивидите, суспектни за ТВ или на пациентите, с активна ТВ. В същото време обаче, поради ограниченията на микробиологичните и молекулярно-биологичните тестове за диагностициране на МTB, особено при деца и при извънбелодробните форми на туберкулоза, и в търсене на бързи и ефективни диагностични методи при туберкулозната инфекция, имунодиагностиката бива разглеждана като привлекателна алтернативна възможност. Тя използва основно специфичните клетъчните имунни отговори на гостоприемника, за да покаже наличието на инфекция или заболяване. Туберкулиновият кожен тест²⁷ и неотдавна въведените нови тестове за антиген-специфично ex vivo освобождаване на IFN-γ(antigen-specific ex vivo release of IFN-γ, IGRA) се използват за идентифициране на инфекцията с MTВ²⁸.

Налице са убедителни доказателства, че както пациентите с туберкулоза, така и индивидите, инфектирани с MTB, изявяват in vivo и ex vivo силен клетъчен имунен отговор към антигените на MTB. In vivo, тази реакция може да бъде измерена чрез отговора от типа „забавена свръхчувствителност” (DTH) към пречистен протеинов дериват на туберкулина (purified protein derivative of tuberculin, PPD); ex vivo, тя може да бъде определена чрез пролиферацията на лимфоцитите, или освобождаването на продуцираните от тях медиатори към различни антигени на МТВ^27,28.

Столетният туберкулинов кожен тест тип МАНТУ

Туберкулиновият кожен тест (ТКТ) се описва за първи път от Robert Koch, а е въведен в практиката от Charles Mantoux през 1907 г.³. През 1890 г., около осем години след откриването на туберкулозния бацил, Robert Koch известява за намерено лекарство срещу туберкулоза. Той получава топлинно-инактивиран филтрат от култури на MTB и открива, че този материал би могъл да защити морски свинчета от експериментална туберкулоза. Този продукт, известен като “Стария туберкулин на Koch”, бива прилаган на пациенти с туберкулоза, а Koch оповестява, че този вид лечение е довело до излекуване от болестта^30,31. Третираните пациенти обаче показали генерализирани системни реакции, в това число втрисане, болки в мускулите и коремно неразположение, с гадене и повръщане, за разлика от индивидите без туберкулоза, които не били развили тази бурна реакция. Тези наблюдения се оказали в основата на предложението за използване на туберкулина като диагностичен тест, независимо от неуспешното му представяне като лекарствено средство. Туберкулиновият кожен тест се прилага в практиката вече повече от век.

Реакцията към интрадермално инжектирания туберкулин е класически пример за реакция от типа „забавена свръхчувствителност” (DTH). T клетките, сенсибилизирани от предишна инфекция, се струпват в кожния участък, където освобождават лимфокини³². Те предизвикват индурация в участъка, чрез локална вазодилатация, едем, отлагане на фибрин и струпване на други инфламаторни клетки³³. Обичайно реакцията към туберкулин започва 5 до 6 часа след инжектирането, предизвиква максимална индурация на 48 до 72 час и отзвучава за няколко дни. Реакцията силно се повлиява от инфилтриращите се в участъка на инжектирания туберкулин клетки. В ранните часове, последващи инжектирането (4 – 6 часа), болшинството от инфилтриращите клетки са неутрофили³⁴. Около 12-ия час се наблюдава появата на T клетки около кръвоносните съдове³⁵. Максималният брой на инфилтриращите активирани макрофаги се отчита между 24 и 48 час. Болшинството от инфилтриращите клетки са Т клетки, част от които дифундират в епидермиса и интерстициума³⁶. Броят на CD4+ T клетките винаги превишава този на CD8+ T клетките³⁷. Много рано след инжектирането, про-инфламаторните цитокини IFN‑g, TNF‑a и TNF‑b стимулират експресията на адхезионни молекули върху ендотелиума (E‑селектин) и повишават пермеабилитета на локалните кръвоносни съдове. Установено е, че честотата на циркулиращите CD4+CD25+FoxP3+ регулаторни T клетки, би могла да повлияе размера на индурацията при туберкулиновия кожен тест³⁸. CD4+ T клетките, акумулиращи се в кожата след туберкулиновата стимулация, са преобладаващо от CD45+ RO+ паметов фенотип³⁸.

Първоначалният туберкулин на Koch представлява непречистен екстракт от бульон на култивирани туберкулозни бацили. В 1934 г., Siebert³⁹ изготвя опростен белтъчен преципитат на стария туберкулин и го нарича пречистен протеинов дериват (PPD).

Големите вариации при изпълнението на ТКТ и интерпретацията на резултатите от него правят определянето на специфичността и чувствителността му много трудна при ЛТБИ. Мета-анализът на резултатите от 20 големи проучвания показва, че чувствителността на ТКТ е хетерогенна, с приблизителна оценка от 77% (CI, 71% to 82%)⁴⁰. Установено е, че специфичността при BCG не-ваксинирани популации е висока, с приблизителна оценка от 97% (CI, 95–99%). Специфичността на ТКТ обаче при BCG-ваксинирани лица е била хетерогенна и значително много по-ниска, 59% (CI, 46–73%)⁴⁰. Независимо, че ТКТ се използва широко при скриниране за ЛТБИ и за вземане на решение за приложение на профилактика и лечение, най-големият му недостатък е неговата ниска специфичност⁴¹. Причина за това е, че PPD-туберкулин съдържа повече от 200 антигена, които не са специфични само за M. tuberculosis, а се съдържат както в M. bovis BCG ваксината, така и в повечето не-туберкулозни микобактерии¹². Следователно, ТКТ не може да отдиференцира инфекция с вирулентен M. tuberculosis от предхождаща имунизация с BCG или от контакт с не-туберкулозни микобактерии. Установено е, че чувствителността на ТКТ е ниска при HIV- инфектирани и при други имунокомпрометирани индивиди, при които рискът от прогресия към активна туберкулоза е висок⁴². При HIV- инфектирани индивиди туберкулиновата кожна чувствителност рязко спада, следвайки понижението в броя на CD4+ Т клетките⁴². Освен това, много имунокомпетентни индивиди с потвърдена туберкулоза не отговарят на PPD поради изразена анергия⁴³. Въпреки тези си ограничения, ТКТ все още се използва рутинно в клиничната практика за скриниране на МTB инфекция.

За да бъде правилно отчетен и интерпретиран резултата от туберкулиновия кожен тест, необходимо е добро познаване на чувствителността и специфичността, както и на позитивната и негативна предикативна стойност на теста. Чувствителността на даден тест се определя от процента индивиди със заболяване, които манифестират позитивен тестови резултат. Ако делът на фалшиво-негативните резултати е малък, чувствителността на теста е висока. Фалшиво-негативните резултати при ТКТ достигат 25% при първоначалното оценяване на лицата с активна туберкулоза⁴⁴. Причините за този висок дял на фалшиво-отрицателни резултати могат да се търсят в непълноценно хранене и недобро общо здравословно състояние, доминиращо остро заболяване или имуносупресия. Имуносупресията може да бъде специфична или неспецифична (в резултат на приемани лекарства, злокачествени процеси или HIV инфекция)⁴⁴. Поради ниската чувствителност на теста, особено при индивиди с остро заболяване и HIV инфекция, туберкулиновият кожен тест не може да бъде използван за изключване на възможността за активна туберкулоза⁴⁵.

Ниската специфичност е най-голямото ограничение на ТКТ и е в основата на големия брой фалшиво-положителни резултати, вследствие на кръстосана антигенна риактивност след BCG ваксинация или след контакт с не-туберкулозни микобактерии.

Ниската чувствителност на ТКТ обуславя високия процент фалшиво-отрицателни резултати при иначе здрави индивиди и по този начин могат да бъдат пропуснати до 30% от реално инфектираните. Тя е в основата и на повече от 50% фалшиво-отрицателни резултати при имунокомпрометирани индивиди, особено при пациенти с HIV/СПИН.

Туберкулиновият кожен тест може да бъде положителен както при латентна, така и при активна туберкулоза, след скорошен контакт с M. tuberculosis или не-туберкулозни микобактерии, както и след BCG ваксинация.

ТКТ НЕ МОЖЕ ДА РАЗГРАНИЧАВА РАЗЛИЧНИТЕ КЛИНИЧНИ СИТУАЦИИ!

Новият IFN-γ-базиран подход в имунодиагностиката на туберкулозната инфекция

През последните години категорично се наложи необходимостта от създаването на нови, стандартизирани лабораторни тестове, в които се използват високоспецифични антигени на МТВ, за доказване както на латентна, така и на активна туберкулоза. Те трябва да са лесни и удобни за работа, и да дават бързи и сигурни резултати.

С помощта на интензивни ДНК анализи бяха постигнати значителни успехи в идентифицирането на високоспецифични антигени на МТВ. Имунодоминантният антиген ESAT-6 (6-kDa Еarly Secretory Antigenic Target) и хомолозите му се оказаха изключително подходящи за целите на диагностиката на туберкулозната инфекция. Тъй като тези антигени липсват при всички ваксинални BCG щамове, то отсъстват и кръстосани реакции с BCG ваксината. Колективът на проф. Peter Andersen, от Statens Serum Institut в Копенхаген, в процеса на проучване на антигенни фракции от културелни филтрати на MTB и M. bovis, с цел разпознаването им от Т клетките на инфектирани с МТВ индивиди, за първи път идентифицира и характеризира редица антигени с ниска молекулна маса, които представляват главни таргети на клетъчно-медиираните имунни отговори⁴⁶. С помощта на ДНК хибридизацията (subtractive DNA hybridization) на патогенния M. bovis и BCG⁴⁷ и сравнителния микрочипов ДНК- анализ (comparative genome-wide DNA microarray analysis) на MTB H37Rv и BCG, бяха идентифицирани редица региони на различие (Region of Difference, RD) между MTB и M. Bovis, с обозначения от RD1 до RD16. Всички те представляват сегменти, които са били заличени от генома на M. bovis. Регионът RD1 е заличен в ранните етапи на атенюация на M. bovis BCG и следователно, липсва при всички познати днес дъщерни щамове⁴⁷. Този регион стана обект на детайлни проучвания, в резултат на които редица антигени бяха охарактеризирани като кандидат-антигени за участие в проучвания, касаещи както диагностиката, така и разработката на ваксини⁴⁸. Локализираните в този регион антигени ESAT–6 и CFP–10 (Culture Filtrate Protein-10) показаха много висок потенциал за диагностициране на МТВ^49-51.

Въз основа на тези проучвания се създаде една от най-значимите разработки в диагностичния инструментариум при туберкулозната инфекция, IFN-g- базираните тестове (IGRA). Те почиват на принципа, че T клетките на предварително сенсибилизирани индивиди произвеждат IFN‑g, когато повторно срещнат антигените на MTB⁵². Най-същественото предимство на IGRA тестовете е тяхната висока специфичност при откриване на инфекция с MTB, дължаща се на използването на MTB‑специфичните антигени, кодирани в RD1 участъка. Множество проучвания показаха, че IFN‑g– базираните тестове, използващи антигените ESAT-6 и CFP-10, имат редица предимства пред кожното тестуване с туберкулин ^{40-42, 48-58}.

Като основен цитокин на клетъчно-медиирания имунитет, IFN-g е в основата на новите IGRA тестове. Има няколко съществени основания за избор на Т-клетъчно базиран подход при създаването им. На първо място трябва да се подчертае, че M. tuberculosis е вътреклетъчен патоген и трудно се изолира от инфектирани индивиди; хуморалният имунен отговор при ЛТБИ има слаба диагностична стойност; инфекцията, причинена от МTB предизвиква силен Th1-тип клетъчно-медииран имунен отговор, а MTB-специфичната IFN-g продукция може да се използва успешно като маркер за МТВ инфекцията. IFN‑g се продуцира от активираните T- клетъчни популации след специфична стимулация. IFN‑g повишава експресията на MHC Клас I и MHC Клас II молекулите, регулира антиген-специфичните фази на имунния отговор и стимулира анти-микробните отговори на макрофагите, NK клетките и неутрофилите. IFN‑g е специфичен маркер на клетъчно-медиираните отговори, може прецизно да бъде измерен и е стабилен при съхранение^52,53. Много важно е обстоятелството, че IFN‑g не се установява в циркулацията на здрави индивиди!

IFN-γ – базирани тестове (Interferon-Gamma Release Assays – IGRAs)

IGRA тестовете са сред най-големите научни постижения през последните 100 години в имунодиагностиката на туберкулозната инфекция и могат да бъдат определени като Новият имунодиагностичен подход при туберкулозата през 21 век.

В момента в света съществуват две IFN‑g – базирани технологии: първо появилата се през 2000 г. QuantiFERON–TB, на фирмата Cellestis от Австралия (понастоящем “Cellestis, a QIAGEN Company”)⁵⁹ и няколко години по-късно появилата се през 2003 г. T-SPOT.TB, на фирмата Oxford Immunotec от Великобритания⁶⁰.

QuantiFERON-TB Gold In-Tube тест

Хронологично във времето Cellestis предложи три различни генерации на QuantiFERON технологията: през 2000 г. QuantiFERON-TB, с антигени PPD M.tuberculosis, PPD M.bovis и PPD M. Avium (този тест вече не се произвежда), през 2004 г. – QuantiFERON-TB Gold (с антигени ESAT-6 и CFP-10), и през 2006 г. -  подобреният му вариант QuantiFERON-TB Gold In-Tube (с антигени ESAT-6, CFP-10 и ТВ7.7). През последните години трета генерация QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-ТВ GIT) тестът се предпочита като най-удобен за работа (Фиг. 3).

QFT-GIT тестът се изработва в два етапа⁵⁹. През първия, кръвта се взема в три отделни епруветки. В една от тях предварително са поставени МТВ-специфичните антигени, във втората (положителната контрола) кръвта се стимулира с поликлонален митоген Фитохемаглутинин (ФХА), а в третата (отрицателна контрола) кръвта не се стимулира. Пробите се култивират за 24 часа при 37⁰ С. През втория етап, в отделените супернатанти се определя количеството на продуцирания IFN-γ с помощта на ELISA метода.

Начинът на отчитане на резултатите от QFT-?IT теста, е представен в Таблица 1:

Таблица 1. Отчитане на резултатите в QuantiFERON-TB Gold In-Tube теста:

*Да се повтори

T-SPOT.TB тест

T-SPOT.TB е по-новият и по-късно появил се през 2004 г. IFN-g- базиран кръвен тест, също предназначен за употреба като помощно средство за диагностициране на латентна и активна туберкулозна инфекция. Т-SPOT.ТВ тестът превъзхожда останалите имунодиагностични тестове (QFT-GIT и ТКТ) по високата си чувствителност (до 95%), дори при имуносупресирани индивиди. Резултатите на Т-SPOT.TB теста не се повлияват неблагоприятно от наличието даже и на по-силно изразена имуносупресия, а нивото на неопределените резултати в повечето проучвания  е ниско (до 2-3%). Достойнство на T-SPOT.TB теста е обстоятелството, че той работи с точно определен брой клетки, които след изолирането им от цялата кръв могат да бъдат щателно морфологично характеризирани (Фиг. 4).

T-SPOT.TB тестът също се изработва в два основни етапа⁶⁰. В първия, чрез градиентно центрофугиране, се изолира само лимфоцитната фракция, след което се определя броят на клетките, които се посяват в точно определена концентрация в четири позиции: отрицателна контрола, в която клетките не се стимулират, Панел А, в който клетките се стимулират с антиген ESAT-6, Панел В – с антиген CFP-10 и положителна контрола, в която клетките се стимулират с поликлонален митоген Фитохемаглутинин. След култивиране на пробите за 24 часа при 37⁰ С, с помощта на ELISPOT метода се определя точният брой на IFN-g – продуциращите, спот-образуващи специфични Т клетки. В T-SPOT.TB теста молекулите IFNg, секретирани от сенсибилизираните към антигените на МТВ лимфоцити, се свързват специфично с анти-IFN-g моноклоналните антитела, които предварително са имобилизирани върху нитроцелулозната хартия, с която е покрито дъното на плаката.

Начинът на отчитане на резултатите от T-SPOT.TB теста е представен в Таблица 2:

Таблица 2. Отчитане на резултатите в T-SPOT.TB теста

*Да се повтори

Предимства на T-SPOT.TB теста при отчитането на IFN-γ

• Важно преимущество T-SPOT.TB теста е, че при неговото изпълнение може да се използва T-cell Xtend реактива, който дава възможност кръвните проби да се изработват до 32 часа след вземането им, особено в случаите, когато пробите трябва да се пренасят на големи разстояния. По този начин се подобрява гъвкавостта и се разширява обсегът на работа. Това обстоятелство улеснява изследователя и му дава по-голяма свобода.
• Още по-голямо преимущество на ELISPOT метода е обстоятелство, че продукцията на IFN-g се определя на ниво единична клетка, което дава много по-ясна представа за нейната функционална активност и възможност да отговори на антигенен стимул. С ELISPOT може да се определи наличието на една единствена антиген-специфична, IFN-g-продуцираща клетка, сред други 60 000 клетки.
• При T-SPOT.TB теста, по време на 24-часовото култивиране, изолираните лимфоцити не са изложени на въздействието на различните съставни части на цялата кръв (клетъчни популации и продуцираните от тях медиатори, които могат да бъдат с възможно допълнително инхибиращо или стимулиращо действие).
• Когато се работи с цяла кръв, както това е при QFT-ТВ GIT теста, количеството на продуцирания IFN-g може да бъде повлияно неблагоприятно от гореизброените фактори, което би могло да се отрази на крайния резултат на изследването, особено при малки деца и индивиди с имуносупресия.
• Важно е да се отбележи, че при извънбелодробна туберкулоза с T-SPOT.TB теста могат да се определят специфични за МТВ, IFN-g-продуциращи клетки в бронхо­алвеоларен лаваж, плеврална, перикардна, абдоминална и цереброспинална течност!
• Когато се проследява ефектът от приложението на специфична противотуберкулозна терапия, с отчитане степента на понижение (до изчезване) на МТВ- специфично продуцирания IFN-g, по-удачен е T-SPOT.TB тестът, който дава по-ясна и по-точна представа за количествените промени в хода на терапията.

В Методическото указание за насочване, диагноза, проследяване и лечение на лицата с ЛТБИ на Министерството на здравеопазването, 2011 г.⁴, са посочени случаите, в които трябва да се предпочете използването на T-SPOT.TB теста:

• Пациенти с HIV/СПИН, с изразен имунен дефицит, с абсолютен брой на CD4+ T клетките < 200 кл/мкл
• Деца с HIV/СПИН
• Пациенти, получаващи имуносупресивна терапия
• Деца на възраст до 5 години

Интерпретация на резултатите от IGRA тестовете

Интерпретацията на IGRA тестовете се базира или на общото количество на продуцирания IFN- (QFT-GIT), или на броя клетки, които са продуцирали IFN-g (T-SPOT.TB), след стимулация с високоспецифичните антигени на МТВ. При описание на резултатите се посочват както стойностите на отчетения IFN- в отделните тестови позиции (Отрицателна контрола, МТВ-специфични антигени и Положителна контрола), така и крайната интерпретация на резултата (Отрицателен, Положителен или Неопределен)⁴.

I.   Положителен резултат в IGRA тест: изследваното лице е инфектирано с M.tuberculosis и може да бъде определено като лице с латентна туберкулозна инфекция. Положителният тест не доказва категорично наличието на активна туберкулоза:

1. 1.     При изграждане на диагнозата туберкулозна инфекция, трябва да се включи разглеждането и на наличните епидемиологични данни, медицинската история, както и на всяка друга клинична информация.
2. 2.     Лице с положителен IGRA резултат трябва да бъде оценено за:

• Вероятност за МТВ инфекция (да се търсят данни за експозиция).
• Риск от прогресия към активна туберкулоза (при лица в много малка възраст, в напреднала възраст, при наличие на диабет, имуносупресия).
• Симптоми и признаци на активна туберкулоза.
• Ако рискът, симпомите или признаците са налице, необходими са допълнителни изследвания, за да се определи дали лицето е с ЛТБИ, или е с активна туберкулоза.

Забележка: При здрави индивиди, единичен положителен IGRA резултат, не трябва да се приема като надеждно доказателство за инфекция с M. tuberculosis и първоначалният положителен резултат трябва да бъде потвърден, за да се приеме за сигурно положителен.

3.  Диагнозата ЛТБИ изисква да се изключи наличието на активна туберкулоза чрез медицинска оценка:

• Подробна медицинска история.
• Физикален преглед, за да се провери за предполагаеми симптоми и признаци.
• Рентгенография на бял дроб.
• Когато е показано, изследване на храчка или други клинични проби за наличие на М. tuberculosis.

4.  При съмнение за активна туберкулоза (при лицата, които имат симптоми, признаци или рентгенографски данни за активна туберкулоза, или са с повишен риск от развитие на активна туберкулоза) трябва да се знае, че:

• Положителният IGRA резултат се приема като доказателство за наличието на туберкулозна инфекция.
• Отрицателният IGRA резултат не е достатъчен, за да изключи напълно МТВ инфекция, и клиничната преценка трябва да посочи дали е необходима друга дигностика.
• При здрави индивиди, единичен положителен IGRA резултат, не трябва да се приема като надеждно доказателство за инфекция с M. tuberculosis и първоначалният положителен резултат трябва да бъде потвърден.

II.   Отрицателен резултат в IGRA тест: изследваното лице не реагира на антигените, включени в съответния IGRA тест, по-вероятно е лицето да не е инфектирано с M.tuberculosis.

III.  Неопределен резултат в IGRA: Неопределен резултат може да се получи в случаите, когато:

1. Отговорът към поликлонален митоген Фитохе­ма­глу­тинин е силно потиснат, или липсва (това може да се дължи или на понижен брой на Т лимфоцитите, или на тяхната понижена функционална активност, което води до невъзможност те да продуцират IFN-g; случаите с неопределен резултат се наблюдават по-често при използване на QFT-GIT теста, който работи с цяла кръв, в която броят на Т лимфоцитите е неизвестен, за разлика от T-SPOT.TB теста, който работи с точно определен брой на изолирани лимфоцити от цяла кръв).
2. Отрицателната контрола на теста е висока (високата стойност на отрицателната контрола може  да се дължи или на наличието на хетерофилни антитела, или на повишена спонтанна продукция на IFN-g, което е израз на хронична имунна активация).
3. Много малко са проучванията с IGRA тестовете, посветени на оценката на рисковите фактори, които влияят на неопределените резултати. Ограничени са и проучванията относно стратегиите за повторно тестуване, в това число и за времето на повторното изследване. Kobashi et al, (2009)⁶¹ в свое голямо проучване в Япония, установяват, че слабата митогенова контрола в QFT- Gold теста е била асоциирана с напредналата възраст на някои от пациентите и наличието на имуносупресия (съпроводена от лимфоцитопения и хипоалбуминемия). Веднага след изследването с QFT- Gold теста същите пациенти са били изследвани и с T-SPOT.TB теста, като в 65% от случаите този път резултатите са били валидни.

При лица с неопределен резултат IGRA тестът трябва да се повтори, а те да бъдат щателно изследвани за наличието на имуносупресия и/или активна туберкулоза.

1. Лицата със сигурно положителен ТКТ или IGRA тест се приемат за инфектирани с МТВ.
2. Диагнозата ЛТБИ и решението за последващо поведение не могат да се основават само на резултатите от ТКТ или IGRA тестовете.
3. За поставяне на диагноза ЛТБИ е задължително да се изключи активна белодробна или извънбелодробна туберкулоза, със съответната медицинска оценка.

Специфичност, чувствителност, позитивна и негативна предиктивна стойност на IGRA тестовете

• Специфичността на IGRAs варира от 97.1% (95% CI: 86.8-99.9%95% CI: 86.8-99.9%) за T-SPOT.TB до 99% (95% CI: 97.6-100%) за QFT-?IT ^40,55. Специфичността на ТКТ при BCG-неваксинирани индивиди е до 93%, но при BCG-ваксинираните тя рязко спада до 59%!
• Чувствителността на IGRAs, установена при пациенти с активна туберкулоза, е до 95.6% за T-SPOT.TB и до 86% за QFT- GIT ^40,56,56a. Чувствителността на ТКТ е 73-85%.
• Позитивната предиктивна стойност (ППС) на IGRA тестовете за прогресия към активна туберкулоза е 2.7% (95% CI, 2.3%-3.2%), сравнена с 1.5% за ТКТ (p<0.0001). ППС на IGRA тестовете е значимо по-висока от тази на ТКТ при имунокомпетентни индивиди, поради по-високата тестова специфичност и по-висока чувствителност. ППС нараства до 6.8% (95% CI, 5.6%-8.3%) и 2.4% (95% CI, 1.9%-2.9%) респективно за IGRAs и ТКТ, в случаите, когато е определяна само при високо рискови групи пациенти (P < 0.0001)⁶².
• Негативната предиктивна стойност (НПС) за прогресия към активна ТВ при имунокомпетентни индивиди е 99.7% (95% CI,99.5-99.8%) както за QFT-?IT, така и за T-SPOT.TB (95% CI, 94.5-99.4)⁶². При имунокомпрометирани индивиди НПС на IGRAs предстои да бъде уточнена.
• При BCG-ваксинирани лица степента на съответствие между двата IGRA теста е висока, докато съответствието на данните от туберкулиновия кожен тест и IGRAs е слабо, в резултат на фалшиво-положителните резултати от ТКТ.
• Високата чувствителност на IGRA тестовете допринася за по-акуратното идентифициране на лицата с МТВ инфекция, като максимално се повишават истински положителните резултати и се свеждат до минимум фалшиво- положителните.
• Тест с ниска специфичност би „произвел” голям брой фалшиво-отрицателни резултати при индивиди, които наистина са инфектирани. В такъв случай те няма да бъдат лекувани и могат да развият бързо активна туберкулозна болест, особено ако са имунокомпрометирани.

Приложение на IGRA тестовете в практиката

Много са клиничните и епидемиологични показания за приложение на IGRA тестовете. Те с успех могат да се прилагат както при латентна, така и при активна туберкулоза, при деца, без разлика на възрастта им, при лица с различна по степен изразена имуносупресия, при скриниране на лица, контактни с активна туберкулоза, скриниране на медицински персонал и др. (Табл. 3)

В Методическото указание на МЗ са посочени рисковите групи медицински персонал, които подлежат на еднократно годишно тестуване с IGRA тестовете⁴:

1. Работещи във фтизиатрично отделение/клиника и бронхологичен кабинет или отделение.
2. Работещи в патологоанатомични отделения.
3. Работещи в микробиологични лаборатории, извършващи диагностика на МТВ.

Предимства на IGRA тестовете пред ТКТ

1. Значително предимство на IGRA тестовете пред ТКТ е обстоятелството, че в тях са включени отрицателна и положителна контрола: Отрицателната контрола показва нивото на неспецифична имунна реактивност, а положителната, в която се измерва отговорът на Т клетките към поликлонален митоген ФХА, показва функционалната активност на Т лимфоцитите.
2. При липсващ митогенов отговор резултатът от теста е „неопределен”, но дава съществена информация за състоянието на имунната система, особено при имунокомпрометирани пациенти.
3. За разлика от ТКТ, IGRA тестовете разграничават истински отрицателните резултати от анергичните!
4. IGRA тестовете показват по-добра корелация с обхвата на експозиция към туберкулоза, отколкото ТКТ..

Предимствата на IGRAs за пациента

1. Еднократно посещение.
2. Резултатът се получава в рамките на 24 часа.
3. Висока специфичност и чувствителност.
4. Липсват грешки при изпълнение и отчитане на резултатите от IGRA теста (често срещани при ТКТ).
5. При последващо изследване не се получава “boostеr” ефект.
6. Предхождаща BCG ваксинация не причинява фалшиво-положителен IGRA резултат!
7. Употребата на IGRA тестовете е икономически ефективно решение при извършване на скрининг за туберкулоза.

Приложение на IGRAS при активна туберкулоза

1. Чувствителността на IGRAs и особено на T-SPOT.TB теста, при установяване на активна TB е по-висока от тази на Манту теста!
2. Чувствителността на IGRAs обаче, все още не е достатъчно висока, за да могат те да се използват като тестове, изключващи категорично активна туберкулоза.
3. IGRAs са помощни тестове при изграждане диагнозата Туберкулоза.
4. IGRA тестовете не разграничат активна от латентна туберкулозна инфекция!

Въпреки необходимостта от бъдещи проучвания относно клиничното използване на IGRA тестовете при активна туберкулоза, както при имунокомпетентни, така и при имунокомпрометирани пациенти, повечето проведени изследвания показват отчетливо превъзходството им пред туберкулиновия кожен тест.

Силата на специфичния IFN-γ отговор в IGRA тестовете корелира с размера на МТВ- бактериалния товар

През последните години бяха публикувани резултатите от няколко големи проучвания, посветени на връзката между силата на специфичните отговори към RD1 антигените на M.tuberculosis, определени по продукцията на IFN-g, и големината на МТВ- бактериалния товар. През 2009 г. Metcalf et al.,⁶³ с помощта на QFT-GIT теста установяват, че Т-клетъчните отговори към ESAT-6 и CFP-10 антигените са значимо по-високи при пациентите с активна туберкулоза, отколкото тези при латентно инфектирани индивиди. Използвайки T-SPOT.TB теста, колективите на Kobashi K. (2010)⁶⁴ и Hinks T. (2009)⁶⁶ също установяват, че при болни с активна туберкулоза количеството на специфично-продуцирания IFN-g, е по-голямо от измереното при латентно инфектирани лица. Подобни са резултатите и на колектива на Vincenti D. (2007)⁶⁷, който за първи път разработи този проблем, използвайки ELISPOT метода.

Резултатите от всички тези изследвания са доказателство за това, че при болни с активна туберкулоза продукцията на IFN-g е значимо по-висока, отколкото при лицата с ЛТБИ – факт, който има значение при поставяне на окончателната диагноза.

Приложение на IGRAs с използване на НЕ – кръвни проби

С T-SPOT.TB теста могат да се определят МТВ- специфични IFN-g-продуциращи клетки в телесни течности като бронхоалвеоларен лаваж (БАЛ), плеврална, перикардна, цереброспинална и абдоминална течност, (паралелно с изследването на IFN--продуциращите клетки в периферна кръв), като по този начин може да се подкрепи диагнозата туберкулоза на мястото на болестта. За първи път колективът на Jafari C.  през 2006 г.⁶⁸ публикува данни от свое голямо проучване, в което бе разработена идеята с помощта на T-SPOT.TB теста да се доказват антиген-специфични, IFN-g-продуциращи Т клетки в БАЛ, при пациенти с белодробна туберкулоза, с отрицателна директна микроскопия. Резултатите демонстрират, че Т-клетъчните отговори към специфичните антигени ESAT-6 и CFP-10 са значимо по-високи в БАЛ, отколкото в периферната кръв на тези пациенти, при които и периферната кръв, и БАЛ са изследвани едновременно. Подобни резултати са получени и при пациенти с извънбелодробна туберкулоза^69-72.

Мониториране ефекта на анти-ТВ терапия с помощта на IGRAs

В много случаи, специфичните Т-клетъчни отговори към RD1 антигените на M. tuberculosis се понижават в хода на успешна анти-ТВ терапия и имат клинична стойност като допълнително средство за оценка ефекта от фармакологичната интервенция при активна туберкулоза. Така например, Adetifa I. et al. (2010)⁷³ установяват, че приложението на шест-месечна анти-ТВ терапия е индуцирало качествена и количествена промяна (към негативиране) на първоначалния положителен T-SPOT.TB резултат, при новодиагностицирани пациенти с активна туберкулоза. Този процес е имал дву-фазова динамика, изразяваща се в значителен спад на броя на специфичните спотове в края на първия месец, и второ значително намаляване след приключване на терапията, в края на шести месец. В свое проучване върху динамиката на IFN-g отговорите, при пациенти с активна белодробна туберкулоза, в хода на противо-туберкулозната терапия, Markova R. et al. (2008)⁷⁴, установиха, че в края на девети месец от началото на терапията, при благоприятно повлиялите се пациенти, специфичните отговори към ESAT-6 и CFP-10 антигените са били негативирани. Подобни са наблюденията и на Carrara S et al. (2004)⁷⁵, които установават, че в края на третия месец, при част от пациентите с активна туберкулоза, с добър терапевтичен ефект, ESAT-6- и CFP-10- специфичните отговори са били негативни.

Методически указания за приложението на IGRA тестовете

Към настоящия момент, в световен аспект, с IGRA тестовете са проведени повече от 700 проучвания, в които са изследвани всички ключови клинични групи: суспектни за туберкулоза лица, контактни на активна ТВ, имуносупресирани (HIV/СПИН, анти-TNF-a терапия, хронична бъбречна недостатъчност, злокачествени новообразувания, трансплантирани, пациенти с диабет, с хематологични заболявания), здравни работници и деца^76-82 .

Обобщените резултати от тези проучвания са в основата на публикуваните 33 методически указания за начина, по който трябва да бъдат прилагани IGRA тестовете^4,83,84.

В методическите указания на различните държави са описани четири основни подхода за приложение на IGRA тестовете:

• двустъпков подход, с първоначално приложение на ТКТ и в случай на положителен резултат – приложение на IGRA тест;
• приложение само на IGRA тест, който изцяло да замени ТКТ;
• едновременно приложение на ТКТ и IGRA тест
• избор или на ТКТ или на IGRA тест, но не и на двата теста заедно.

В България, в Методическото указание за насочване, диагноза, проследяване и лечение на лицата с ЛТБИ на Министерството на здравеопазването (2011 г.)⁴ са посочени три основни подхода, съобразени с особеностите на различните групи изследвани лица:

1. ТКТ при всички лица, показани за изследване.
2. Дву-стъпков подход:

• При контактни с активна ТВ
• При серийно тестуване на медицински персонал
• При деца от всички възрасти

3. Самостоятелно прилагане на IGRA тестове:

• При пациенти с HIV/СПИН
• Преди започването на аnti-TNF-γ терапия
• При пациенти с ХБН, на хемодиализа
• При пациенти, получаващи имуносупресивна терапия
• При трансплантирани пациенти

Задължителни изисквания при работа с IGRA тестове

1. Лабораторията, прилагаща IGRA тестове в рутинната си диагностична дейност, трябва да бъде сертифицирана имунологична лаборатория.
2. При работа с IGRA тестове трябва строго да се спазват инструкциите на съответната фирма-производител.
3. При отчитане на резултатите от IGRA тестовете е задължително използването на оригинален софтуер на съответната фирма-производител.
4. Резултатите от QuantiFERON-TB Gold In-Tube и T-SPOT.TB трябва задължително да бъдат представени в оригинален фиш на съответната фирма–производител.
5. Специалистът-имунолог е отговорен за избора на един от двата IGRA тестове при всеки отделен случай.

Литература:

1. World Health Organization. Report on Global tuberculosis control 2010. Available from: www.who.int/tb/data
2. Mack U, Migliori GB, Sester M, et al. LTBI: latent tuberculosis infection or lasting immune responses to M. tuberculosis? A TBNET consensus statement. Eur Respir J 2009; 33:956–973.
3. Singh M., A.G. Saini, N. Anil and A. Aggarwal. Latent tuberculosis in children: diagnosis and management. Indian. J. Paediatr. 2011; 78: 464–468.
4. Методическо указание за насочване, диагноза, проследяване и лечение на лицата с ЛТБИ, МЗ, 27 Януари, 2011.
5. Barnes P. Diagnosting latent tuberculosis infection. Turning glitter to gold. Am. J. of Resspir. And Crit. Care Med. 2004; 170, 5-6.
6. Bhatt K. and P. Salgame. Host innate immune response to Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Immunol. 2007; 4: 347–362.
7. Lin P.L. and J.L. Flynn.. Understanding latent tuberculosis: a moving target. J. Immunol. 2010; 185: 15–22.
8. Schwander S and Dheda K. Human Lung Immunity against Mycobacterium tuberculosis. Insights into Pathogenesis and Protection. Am J Respir Crit Care Med 2011; Vol 183. pp 696–707.
9. Co D.O., L.H. Hogan, S.I. Kim and M. Sandor. Mycobacterial granulomas: keys to a long-lasting host-pathogen relationship. Clin. Immunol. 2004; 113: 130–136.
10. Day T.A., M. Koch, G. Nouailles, et al. Secondary lymphoid organs are dispensable for the development of T-cell-mediated immunity during tuberculosis. Eur. J. Immunol. 2010; 40: 1663–1673.
11. Gideon H.P. and J.L. Flynn. Latent tuberculosis: what the host “sees”? Immunol. Res. 2011; 50: 202–212.
12. Young D et al. Chronic bacterial infection: living with unwanted guests. Nature Immunology 2002; vol.3, 11.
13. Sandberg et al. Functional heterogeneity of cytokines and cytolytic effector molecules in human CD8+ T-lymphocytes. J. Immunol. 2001; 167:181-187.
14. Turner J. et al. In Vivo IL-10 Production Reactivates Chronic Pulmonary Tuberculosis in C57BL/6 Mice. J. Immunol. 2002; 169: 6343–6351
15. Flynn J.L., J. Chan, K.J. Triebold, D.K. Dalton, T.A. Stewart and B.R. Bloom. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J. Exp. Med. 1993; 178:2249–2254.
16. Yan B. S. et al. Progression of pulmonary tuberculosis and efficiency of Bacillus Calmete-?uerin vaccination are genetically controlled via a common sst1-media J. Immunol, 2007; Nov. 15; 179(10): 691-32.
17. Borelli V. et al. Human eosinophil peroxidase induces surface alteration, killing and lysis of M. tuberculosis. Infect. Immun. 2004; 71:605-613
18. Lasco T. et al. Rapid accumulation of eosinophils in lung lesions in guinea pigs infected with M. tuberculosis. Infect. Immun. 2004; 72:1147-1149.
19. Reed M. et al. A glycolipid of hypervirulenttuberculosis strains that inhibits the innate immune response. Nature, 2004; 43, 84 -87.
20. Clifton Barry et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nature Reviews Microbiology 2009; 7, 845-855.
21. Guidry T.V., R.L.Jr. Hunter and J.K Actor. Mycobacterial glycolipid trehalose 6,6’-dimycolate-induced hypersensitive granulomas:contribution of CD4+ lymphocytes. Microbiology 2007;153:3360–3369.
22. Harding J.S., H.A. Schreiber and M. Sandor. Granuloma transplantation: an approach to study Mycobacterium-host interactions. Front. Microbiol 2011; 2: 245.
23. Niki M. and S. Matsumoto. Host and bacterial factors that regulate Mycobacterium tuberculosis infection and persistence. pp. 215–238. In: Takii T., Maeyama J. and S. Yamamoto (eds). BCG. Vaccine and adjuvant. Jata Press, Tokyo, Japan, 2011.
24. Saunders B.M. and A.M. Cooper. Restraining mycobacteria: role of granulomas in mycobacterial infections. Immunol. Cell. Biol. 2000; 78: 334–341.
25. Ahmad S. New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection. Respir. Res. 2010; 11: 169–185.
26. Lillebaek T., A. Dirksen, I. Baess, B. Strunge, V.O. Tomsen and A.B. Andersen. Molecular evidence of endogenous reactivation of Mycobacterium tuberculosis after 33 years of latent infection. J. Infect. Dis. 2002; 185: 401–404.
27. Huebner RE, Schein MF, Bass JB Jr. The tuberculin skin test. Clin Infect Dis 1993; 17: 968-75 52.
28. Pai M, Riley LW, Colford JM (Jr). Interferon-?amma assays in the immunodiagnosis of tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis 2004; 4:761-76.
29. Lalvani A, Brookes R, Wilkinson R, et al. Human cytolytic and interferon gamma secreting CD81T lymphocytes specific for Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 270-5.
30. Kaufmann SHE. Robert Koch’s highs and lows in the search for a remedy for tuberculosis. Nature Medicine Special Web Focus: Tuberculosis (2000).
31. Gradmann C. Robert Koch and the white death: from tuberculosis to tuberculin. Microbes Infect 2006; 8: 294-301.
32. Tsicopoulos, A., Q. Hamid, V. Varney, S. Ying, R. Moqbel, S. R. Durham, and A. B. Kay. Preferential messenger RNA expression of Th1-type cells (IFN-?amma+, IL-2+) in classical delayed-type (tuberculin) hypersensitivity reactions in human skin. J. Immunol. 1992; 148:2058–2061.
33. Colvin, R. B., M. W. Mosesson, and H. F. Dvorak. Delayed-type hypersensitivity skin reactions in congenital afibinogenemia: lack of fibrin deposition and induration. J. Clin. Invest. 1979; 63:1302–1306.
34. Duke O, Panayi GS, Janossy G, Poulter LW. An immunohistological analysis of lymphocyte subpopulations and their microenvironment in the synovial membranes of patients with rheumatoid arthritis using monoclonal antibodies. Clin Exp Immunol 1982; 49: 22–30.
35. Platt JL, Grant BW, Eddy AA, Michael AF. Immune cell populations in cutaneous delayed-type hypersensitivity. J Exp Med 1983; 158: 1227–1242.
36. Poulter LW, Seymour GJ, Duke O, Janossy G, Panayi G. Immunohistological analysis of delayed-type
hypersensitivity in man. Cell Immunol 1982; 74: 358–369.
37. Picker LJ, Treer JR, Ferguson-Darnell B, Collins PA, Bergstresser PR, Terstappen LW. Control of lymphocyte recirculation in man. II. Differential regulation of the cutaneous lymphocyte-associated antigen, a tissue-selective homing receptor for skin-homing T cells. J Immunol 1993; 150: 1122–1136.
38. Sarrazin H, Wilkinson KA, Andersson J, et al., Association between tuberculin skin test reactivity, the memory CD4 cell subset, and circulating FoxP3-expressing cells in HIV-infected persons. J Infect Dis 2009; 199: 702–710.
39. Seibert F.B. The isolation and properties of the purified protein derivative of tuberculin. Am Rev Tuberculosis. 1934; 30: 713.
40. Pai M., A. Zwerling and D. Menzies. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Ann. Intern. Med. 2008; 149: 177–184.
41. Richeldi L. An update the diagnosis of tuberculosis infection. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2006; 174: 736–742.
42. Santin M., S. Casas, M. Saumoy, A. Andreu, R. Moure, F. Alcaide, E. Ferrer and D. Podzamczer. Detection of latent tuberculosis by the tuberculin skin test and a whole-blood interferon-? release assay, and the development of active tuberculosis in HIV-seropositive persons. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2011; 69: 59–65.
43. Holden, M., M. R. Dubin, and P. H. Diamond. Frequency of negative intermediate-strength tuberculin sensitivity in patients with active tuberculosis. N. Engl. J. Med. 1971; 285:1506–1509.
44. Rooney, J. J., J. A. Croceo, and S. Dramer. Further observations on tuberculin reactions in active tuberculosis. Am. J. Med. 1976; 60:517–522.
45. Bass, J., Jr. The tuberculin test. In L. Reichman and E. Herschfield, editors. Tuberculosis. Marcel Dekker, New York. 1993; 139–148.
46. Sorensen AL, Nagai S, Houen G, Andersen P, Andersen AB. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 1995; 631: 710-7.
47. Mahairas GG, Sabo PJ, Hickey MJ, Singh DC, Stover CK. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J Bacteriol 1996; 178: 1274–82.
48. Andersen P, Munk ME, Pollock JM, Doherty TM. Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 2000; 356: 1099-04.
49. Arend SM, Andersen P, van Meijgaarden KE, et al. Detection of active tuberculosis infection by T cell responses to early-secreted antigenic target 6-kDa protein and culture filtrate protein-10. J Infect Dis 2000; 181: 1850-4.
50. Brock I, Munk ME, Kok-Jensen A, Andersen P. Performance of whole blood IFN-?amma test for tuberculosis diagnosis based on PPD or the specific antigens ESAT-6 and CFP-10. Int J Tuberc Lung Dis 2001; 5: 462-7.
51. Tufariello JM, Chan J, Flynn JL. Latent tuberculosis: mechanisms of host and bacillus that contribute to persistent infection. Lancet Infect Dis 2003; 3: 578-90.
52. Lalvani A, Pathan AA, McShane H, et al. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 824-8.
53. M. Amicosante, R. Markova. Rational use of immunodiagnostic tools for tuberculosis infection. Probl Infect Paras Dis, 2009, Suppl. 37, 5-32.
54. R. Markova, R. Drenska, P. Minchev, Y. Todorova, M. Ciccozzi, M. Amicosante. Association of age with the level of response in the QuantiFERON-TB Gold In-Tube assay for children with active tuberculosis. New Microbiologica 2011, 34, 81-85.
55. R Diel; D Goletti; G Ferrara; G Bothamley; D Cirillo; B Kampmann; C Lange; M Losi; R. Markova, G B Migliori; et al; Interferon-? release assays for the diagnosis of latent M. tuberculosis infection: A systematic review and meta-analysis. Eur Respi J, 2011, 37(1):88-99.
56. Sester M, Sotgiu G, Lange C, Giehl C, Girardi E, et al. Interferon-?amma release assays for the diagnosis of active tuberculosis: A systematic review and meta analysis. Eur Respir J 2011; 37(1):100-111.
56a. T-SPOT.TB Package Insert. Available from http://www.oxfordimmunotec.com/
57. Soysal A, Bakir M. T-SPOT.TB assay usage in adults and children. Expert Rev Mol Diagn. 2011; 11(6):643-60.
58. Denkinger, CA, K. Dheda, M. Pai. Guidelines on interferon-c release assays for tuberculosis infection: concordance, discordance or confusion? Clin Microbiol Infect, 2011; 17: 806–814.
59. Cellestis. QuantiFERON-TB Gold In-Tube 2011; Available from:http://www.cellestis.com
60. Oxford Immunotec. T-SPOT.TB. 2011; Available from http://www.oxfordimmunotec.com/.
61. Kobashi Y, et al. Indeterminate results of QuantiFERON TB-2G test performed in routine clinical practice. Eur. Respir. J. 2009;33:812–815.
62. Diel R, Loddenkemper R, Nienhaus A. Predictive value of interferon-? release assays and tuberculin skin testing for progression from latent TB infection to disease state: a meta-analysis. Chest. 2012;142(1):63-75.
63. Metcalfe JZ, Cattamanchi A, Ho C, Grinsdale J, Kawamura M. Quantitative interferon-?amma release and classification of tuberculosis suspects with ‘negative’ Quantiferon-?old results. Am J Respir Crit Care Med 2009;179:A5920.
64. Kobashi Y, Shimizu H, Ohue Y, Mouri K, Obase Y, Miyashita N, et al. Comparison of T-cell interferon-?amma release assay to Mycobacterium tuberculosis-specific antigens in patients with active and latent tuberculosis. Lung. 2010;188(4):283-7.
65. Diel R, Loddenkemper R, Meywald-Walter K, Gottschalk R, Nienhaus A. Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB-?old In Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest. 2009;135:1010-8.
66. Hinks T et al. Frequencies of Region of Difference 1 Antigen-Specific but Not Purified Protein Derivative-Specific Gamma Interferon-Secreting T Cells Correlate with the Presence of Tuberculosis Disease but Do Not Distinguish Recent from Remote Latent Infections. Infection and Immunity 2009; p. 5486–5495.
67. D. Vincenti, S. Carrara, O. Butera, F. Bizzoni, R. Casetti, E. Girardi, D. Goletti. Response to region of difference 1 (RD1) epitopes in human immunodeficiency virus (HIV)-infected individuals enrolled with suspected active tuberculosis: a pilot study. Clinical and Experimental Immunology, 2007;150: 91–98.
68. Jafari C, Ernst M, Kalsdorf B, Greinert U, Diel R, Kirsten D, et al. Rapid diagnosis of smear-negative tuberculosis by bronchoalveolar lavage enzyme-linked immunospot. Am J Respir Crit Care Med 2006;174:1048-54.
69. Patel VB, Singh R, Connolly C, Coovadia Y, Peer AK, Parag P, Kasprowicz V, Zumla A, Ndung’u T, Dheda K. Cerebrospinal T Cell Responses Aid the Diagnosis of Tuberculous Meningitis in a HIV and TB Endemic Population. Am J Respir Crit Care Med. 2010; 4.
70. Dheda K, van Zyl-Smit RN, Sechi LA, Badri M, Meldau R, Meldau S, Symons G, Semple L, Maredza A, Dawson R, Wainright H, Whitelaw A, Vallie Y, Raubenheimer P, Bateman ED, Zumla A. Utility of quantitative T cell responses versus unstimulated IFN-?amma for the diagnosis of pleural tuberculosis. Eur Respir J. 2009; 2.
71. Ji Young Kang, Chin Kook Rhee, Na Hyun Kang, Ju Sang Kim, Hyoung-Kyu Yoon, Jeong Sup Song. Clinical Utility of Two Interferon-?amma Release Assays on Pleural Fluid for the Diagnosis of Tuberculous Pleurisy. Tuberculosis and Respiratory Diseases 2012;73 (3): 143-150.
72. Jafari C, Kessler P, Sotgiu G, et al. Impact of a Mycobacterium tuberculosis-specific interferon-? release assay in bronchoalveolar lavage fluid for a rapid diagnosis of tuberculosis. J Intern Med 2011; 270: 254–262.
73. Adetifa IMO, Ota MOC, Walther B, Hammond AS, Lugos MD, et al. Decay Kinetics of an Interferon Gamma Release Assay with Anti-Tuberculosis Therapy in Newly Diagnosed Tuberculosis Cases. PLoS ONE 2010; 5(9): e12502.
74. R. Markova , R. Drenska, Y. Todorova, V. TerzievaD. Stefanova. Monitoring the efficacy of anti-TB therapy by using the QuantiFERON-TB Gold In tube test. Eur Respir Rev 2008; 17, 108: 74-76.
75. Stefania Carrara, Donatella Vincenti, Nicola Petrosillo, Massimo Amicosante, Enrico Girardi, Delia Goletti. Use of a T Cell–Based Assay for Monitoring Efficacy of Antituberculosis Therapy. CID 2004:38.
76. Leidl L, Mayanja-Kizza H, Sotgiu G, et al. Relationship of immunodiagnostic assays for tuberculosis and numbers of circulating CD4+ T-cells in HIV-infection. Eur Respir J 2010; 35: 619–626.
77. R. Markova, Y. Todorova, R. Drenska, I. Elenkov, M. Yankova and D. Stefanova. USEFULNESS OF INTERFERON-?AMMA RELEASE ASSAYS IN THE DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS INFECTION IN HIV-INFECTED PATIENTS IN BULGARIA. Biotechnol & Biotechnolog Eq 2009; 23,1:1103-1108.
78. Dheda K, Lalvani A, Miller RF, Scott G, Booth H, Johnson MA, Zumla A, Rook GA. Performance of a T-cell-based diagnostic test for tuberculosis infection in HIV-infected individuals is independent of CD4 cell count. AIDS. 2005; 9(17):2038-2041.
79. Delia Goletti, Carrara Stefania, Ornella Butera, Massimo Amicosante, Martin Ernst, Ilaria Sauzullo, Vincenzo Vullo, Daniela Cirillo, Emanuele Borroni, Roumiana Markova еt al. Accuracy of immunodiagnostic tests for active tuberculosis using single and combined results: a multicenter TBNET Study. PloSONE 2008;3:e3417.
80. Li, H.; Yang, L.; Zheng, C-Y., Wang, J., Abdullah, A. S. Use of bronchoalveolar lavage enzyme-linked immunospot for diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis. IJATLD 2012; 16, 12: 1668-1673.
81. Yun Feng; Ni Diao; Lingyun Shao; Jing Wu; Shu Zhang; Jialin Jin; Feifei Wang; Xinhua Weng; Ying Zhang; Wenhong Zhang. Interferon-?amma Release Assay Performance in Pulmonary and Extrapulmonary Tuberculosis. РLoS ONE, 2012;7,3:1.
82. Robindra Basu Roy, Giovanni Sotgiu, Neus Altet-?omez, Maria Tsolia, Ezia Ruga, Svetlana Velizarova, Beate Kampmann. Identifying Predictors of Interferon-?amma Release Assay Results in Pediatric Latent Tuberculosis: a Protective Role of BCG? Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2012; 186(4):378-84.
83. European Centre for Disease Prevention and Control. Use of interferon-?amma release assays in support of TB diagnosis. Stockholm: ECDC; 2011.
84. C. M. Denkinger, K. Dheda, M. Pai. Guidelines on interferon-c release assays for tuberculosis infection: concordance, discordance or confusion? Clin Microbiol Infect 2011; 17: 806–814.