Резюме
Цел на настоящото проучване е да се диагностицира и потвърди мултирезистентната/екстензивно резистентната туберкулоза (MDR/XDR-TB) от изолати на пациенти от цялата страна през 2011г., като се определи резистентността им към първи и втори ред противотуберкулозни лекарства и се установят основните мутации, отговорни за тази резистентност.
В Националната референтна лаборатория по туберкулоза към Националния център по заразни и паразитни болести (НРЛ ТБ, НЦЗПБ) са проучени общо 324 щама, изолирани от пациенти за едногодишен период от време – през 2011г, на територията на цялата страна. От тях, изолатите на 68 пациента са доказани като MDR-TB.
Най-често срещаната мутация в rpoB гена, определяща резистентност към Рифампицин е S531L в 80,88%, за Изониазид в inhA гена – С15Т (39,70%) и в katG гена – S315T1 (33,82%) от проучените щамове. От MDR-ТB щамовете – 13,23% са резистентни към Офлоксацин, 4,41% – резистентни към Aмикацин, Kанамицин и Kапреомицин, а 10,29% са с XDR-TB – към всички от тестваните втори ред противотуберкулозни лекарства. Най-честата мутация в gyrA гена при резистентните към флуорохинолони е А90V (37,50%), а за резистентните към аминогликозиди и циклични пептиди мутацията А1401G в rrs гена се среща в 100% от случаите.
Ключови думи: мултирезистентна туберкулоза, екстензивно резистентна туберкулоза
Abstract
The aim of the study is to diagnose and confirm Multiple / Extensive Drug-resistant tuberculosis (MDR/XDR-TB) in clinical isolates of patients from all over the country in 2011 by testing their resistance to first and second-line drugs and to detect the mutations in the relevant genes, related to that resistance.
In 2011 in the National Reference Laboratory for Tuberculosis, National Center for Infectious and Parasitic Diseases a total number of 324 isolates from all over the country were tested. Sixty-eight of them were confirmed to be MDR-TB.
The most common mutation in rpoB gene, related to resistance to Rifampicin, was S531L (80,88%), in inhA gene, related to resistance to Isoniazid – С15Т (39,70%), in katG gene – S315T1 (33,82%). 13,23% of the MDR TB strains were resistant to Ofloxacin; 4,41% – to Amikacin, Kanamycin and Capreomycin; 10,29% were XDR-TB with resistance to all of the tested second-line drugs. The most common gyrA mutation in the strains with Fluoroquinolone resistance was A90V – 37,50%, and 100% of the Aminoglycosides/cyclic peptides resistant strains harbor the A1401G mutation in rrs gene.
Кey words: MDR-TB, XDR-TB
Туберкулозата е заболяване, известно от древността1, 2, 3, 4, 5. Въпреки активните действия, предприети в контрола на туберкулозата в световен мащаб, тя остава водеща причина за смъртността от инфекциозните болести6, 7.
Появата на MDR-TB е сериозен проблем на общественото здравеопазване в много страни по света и е пречка за контрола на туберкулозата в глобален мащаб. Докато в клиничен аспект резистентността е следствие на грешки в режима на лечение: неадекватен, неправилно предписан или неспазван, в микробиологичен аспект тя се дължи на генни мутации, които обуславят неефективността на противотуберкулозното лекарство към мутиралия щам M. tuberculosis8, 9, 10. СЗО определя MDR-TB като туберкулоза, причинена от щам M. tuberculosis complex с доказана in vitro резистентност към Изониазид и Рифампицин едновременно, с или без наличие на резистентност към други противотуберкулозни лекарствени препарати от първи ред, а XDR-TB като туберкулоза, причинена от MDR-TB щам, с доказана in vitro резистентност към който и да е препарат от групата на флуорохинолоните и към един или повече от следните инжекционни препарати: Канамицин, Амикацин, Капреомицин”8, 11, 12.
Цел
Цел на настоящото лабораторно проучване е да се диагностицира и потвърди MDR-TB, респективно XDR-TB, от изолати на пациенти от цялата страна през 2011г., като се определи резистентността им към първи и втори ред противотуберкулозни лекарства и се установят основните мутации, отговорни за тази резистентност.
Материали и методи
Настоящото проучване обхваща изолати на пациенти, изследвани в микробиологичните лаборатории по туберкулоза към лечебните заведения в цялата страна, както и в НРЛ ТБ. Тези щамове са изпратени от съответната микробиологична лаборатория в НРЛ ТБ с цел идентификация и изработване на тестове за лекарствена чувствителност към първи и втори ред противотуберкулозни лекарства, използвайки съвременни фенотипни и генетични методи. По този начин в НРЛ ТБ беше осъществена пълната фенотипна и генетична характеристика на всички MDR/XDR-TB щамове през 2011г, изолирани на територията на цялата страна.
Изследваните 324 изолата са от материали на пациенти с показания за микробиологично изследване за туберкулоза и са в съответствие с локализацията на инфекциозния процес: щамове от материали от дихателна система (храчки, бронхоалвеоларен лаваж (БАЛ), трахеални аспирати, плеврални пунктати), стомашнопромивни води при деца, урина, ставни пунктати, меки тъкани и др.
Микробиологичното изследване за туберкулоза изисква предварителна деконтаминация на пробите, съгласно съвременните методики, регламентирани в националните и международни ръководства12,13. Култивирането на пробите е осъществено върху твърди (Льовенщайн-Йенсен) и течни хранителни среди (MGIT).
На получените от страната изолати в НРЛ ТБ е осъществена фенотипна видова идентификация за принадлежност към Mycobacterium tuberculosis complex чрез тестове с пара-нитро бензоена киселина (pNBA) и имунохрамотографски тест (BD), както и генетична идентификация чрез GenoType® CM, AS, MTBDRplus и MTBDRsl (PCR тестове, известни като LPA, базирани на ДНК стрип технология) 14, 15,16,17. Тестове за лекарствена чувствителност към първи и втори ред противотуберкулозни лекарства са изработени само на култури, идентифицирани като Mycobacterium tuberculosis complex. Чувствителността към първи ред противотуберкулозни лекарства е тествана с два метода – фенотипен и генетичен.
Използваният фенотипен метод е конвенционален метод, който по същество е пропорционален метод с критични концентрации на противотуберкулозните лекарства, използвайки течна хранителна среда MGIT на автоматизираната система BАСТЕС® MGIT 960 System със стандартизирани комерсиални китове (SIRE kit) към четирите основни лекарства: Стрептомицин 1,0 µg/ ml, Изониазид 0,1 µg/ ml, Рифампицин 1,0 µg/ ml и Етамбутол 5,0 µg/ ml.
Използваният генетичен метод е молекулярния метод GenoType® MTBDRplus (LPA). С него са тествани ДНК, изолирани от щамовете или директно от клинични материали от дихателната система, положителни на микроскопско изследване за киселинно устойчиви бактерии. Определянето на резистентността към Рифампицин се базира на отчитане на най-важните мутации в гена rpoB, кодиращ β-субединицата на РНК полимеразата. Отчитане на резистентността към Изониазид се базира на мутации в два гена: katG гена, кодиращ ензима каталаза пероксидаза, който активира Изониазида в микобактериалната клетка и промотора на региона на ген inhA, кодиращ NADH-зависима еноил-ACP редуктаза.
Всички туберкулозни щамове, потвърдени в НРЛ ТБ като MDR-TB, са изследвани с тестове за лекарствената чувствителност към втори ред противотуберкулозни лекарства. Проведените методи са също фенотипен и генетичен.
Използваният фенотипен метод е конвенционален метод с течна хранителна среда MGIT и автоматизираната система BАСТЕС® MGIT 960 System, с критични концентрации към четирите основни противотуберкулозни лекарства: Офлоксацин 2,0 µg/ ml, Амикацин 1,0 µg/ ml, Канамицин 5,0 µg/ ml, Капреомицин 2,5 µg/ ml.
Използваният генетичен тест е молекулярния GenoType® MTBDRsl, LPA с изолирана ДНК от щам или директно от материал от дихателна система, положителен на микроскопско изследване за киселинноустойчиви бактерии. Определянето на резистентността към флуорохинолони с този метод се базира на мутации на гена gyrA, кодиращ ензима ДНК-гираза. Определянето на резистентността към аминогликозиди и циклични пептиди се основава на мутации в гена за 16S рРНК (rrs).
Резултати
От изследваните в НРЛ ТБ 324 щама на болни през 2011г., за 282 се установи принадлежност към Mycobacterium tuberculosis complex. От тях изолатите на 68 пациента са определени като MDR-TB.
Разпределението на MDR-TB изолатите по пол е със съотношение 2,77:1 за сметка на мъжете т.е. 50 принадлежат на мъже (73,52%) и 18 щама принадлежат на жени (26,47%). MDR-TB щамовете са изолирани от пациенти, чието местожителство е на територията на 21 области на България (Фигура 1). Най-голям е броят им в областите: София град, Монтана, Пловдив, Варна и Добрич, а нито един MDR-TB щам не е изолиран в областите: Плевен, Силистра, Смолян, Хасково и Кърджали. Разпределени по терапевтична категория, преобладават MDR-TB щамовете на пациенти с предходно лечение на туберкулоза – 44 пациента (64, 70%), докато тези на новорегистрираните пациенти са 24 (35, 29%).
Фигура 1: Разпределение на потвърдените в НРЛ ТБ, MDR-TB щамове през 2011г. по области
Преобладаващата група от 79,41% е на пациенти в трудоспособната възраст от 25 до 65 г. Диагностицирано е и едно дете на 1,6 г. с MDR-TB, с вероятна трансмисия на заболяването от болната майка.
Фигура 2: Възрастова структура на потвърдените в НРЛ ТБ пациенти с MDR-TB щамове през 2011г.
Фенотипната характеристика на MDR-TB щамовете е представена на Фигура 3 (към първи ред противотуберкулозни лекарства) и на Фигура 4 (към втори ред противотуберкулозни лекарства).
Фигура 3: Фенотипна резистентност на MDR-TB щамовете към противотуберкулозни лекарства от първи ред, потвърдени в НРЛ ТБ, през 2011г.
Фигура 4: Фенотипна резистентност на MDR-TB щамовете към противотуберкулозни лекарства от втори ред, потвърдени в НРЛ ТБ, през 2011г.
Най-голям е броят на едновременна резистентност и към четирите тествани лекарства от първи ред (HRSE) – 35 (51,47%), следван от този към Изониазид и Рифампицин едновременно – 15 (22,05%), към Изониазид, Рифампицин и Етамбутол едновременно – 11 (16,17%) и на последно място – към Изониазид, Рифампицин и Стрептомицин едновременно – 7 (10,29%).
От тестваните 68 MDR-TB щама – 49 щама (72,05%) показаха фенотипна чувствителност към Офлоксацин, Амикацин, Канамицин и Капреомицин едновременно. Монорезистентност към Офлоксацин беше установена в 9 щама (13,23%). Резистентност към Амикацин, Канамицин и Капреомицин едновременно, без наличие на резистентност към Офлоксацин, се откри в 3 щама (4,41%). Не беше установен нито един случай на монорезистентност към някой от инжекционните препарати от втори ред. Седем MDR-TB щама (10,29%) бяха определени като XDR-TB щамове, с резистентност и към четирите изпитвани противотуберкулозни лекарства от втори ред. Не беше установен нито един случай на XDR-TB, който да е резистентен към Офлоксацин и само един от инжекционните антибиотици едновременно, а да е чувствителен към другите два.
Генетичната характеристика на MDR-TB щамовете, подобно на фенотипната, е представена по отношение на първи и втори ред противотуберкулозни лекарства, визирайки генните мутации, определящи съответната резистентност.
За първи ред противотуберкулозни лекарства генетичното тестване на ДНК от щамовете/пробите с GenoType® MTBDRplus, установи мутация в rpoB в 97,05% от случаите, като най-често срещаната мутация S531L е отчетена в 80,88%. По отношение за изониазидовата резистентност бяха открити мутации в един от двата гена (katG и inhA) в 77, 94% от случаите (Таблица 1). В 22, 05 % от изолатите с фенотипна мултилекарствена резистентност не се детектира мутация в нито един от двата гена (Таблица 2). Най-честата регистрирана мутация в katG гена е S315T1 и се намира в 33,82% от щамовете; установени са и 5,88% други мутации в същия ген, нуждаещи се от допълнително типиране с други методи. Мутацията С15Т в inhA гена беше открита в 39,70% от случаите.
Таблица 1: Сравнение на резултатите при определяне на MDR-TB с BАСТЕС® MGIT 960 System и GenoType®MTBDRplus
Резистентност към |
Ceno Type® MTBDR plus (n = 68) |
BACTEC® MGIT 960 System MDR (n=68) |
|||||
Ген |
Банд | Регион на мутация | Брой MDR TB | % | |||
rpoB |
∆WT1 |
506-509 |
0 |
0 |
68 |
||
Рифампицин |
∆WT2/WT3 |
510-517 |
1 |
1,47 |
|||
∆WT3/WT4 |
513-519 |
3 |
4,41 |
||||
∆WT4/WT5 |
516-522 |
1 |
1,47 |
||||
∆WT5/WT6 |
518-525 |
0 |
0 |
||||
∆WT7 |
526-529 |
2 |
2,94 |
||||
∆WT8 |
530-533 |
4 |
5,88 |
||||
MUT1 |
D516V |
0 |
0 |
||||
MUT2A |
H526Y |
0 |
0 |
||||
MUT2B |
H526D |
0 |
0 |
||||
∆WT8,MUT3 |
S531L |
55 |
80,88 |
||||
Общо мутации в rpoB |
66 |
97,05 |
|||||
Без мутации в rpoB |
2 |
2,94 |
|||||
Изониазид |
katG |
∆WT |
315 |
4 |
5,88 |
68 |
|
∆WT, MUT1 |
S315T1 |
23 |
33,82 |
||||
∆WT, MUT2 |
S315T2 |
0 |
0 |
||||
Без мутации в katG |
41 |
60,29 |
|||||
inhA |
∆WT1 |
15/16 |
0 |
0 |
|||
∆WT2 |
8 |
0 |
0 |
||||
∆WT1,MUT1 |
C15T |
27 |
39,7 |
||||
MUT2 |
A16G |
0 |
0 |
||||
MUT3A |
T8C |
0 |
0 |
||||
MUT3B |
T8A |
0 |
0 |
||||
Без мутации в inhA |
41 |
60,29 |
|||||
Таблица 2: Сравнително разглеждане на резултатите от BACTEC® MGIT 960 System и GenoType®MTBDRplus при определяне на резистентността към Изониазид
Ресистентност към Изониазид, определена чрез мутации, откривани с Geno Type®, MTBDRplus |
BACTEC® MGIT 960 System |
||
Вид мутации |
Брой |
% |
68 |
Мутации само в katG |
27 |
39,7 |
|
Мутации само в inhA |
27 |
39,7 |
|
Мутации в katG и inhA едновременно |
1 |
1,47 |
|
Без мутации в katG и inhA |
15 |
22 |
За втори ред противотуберкулозни лекарства генетичното тестване с GenoType ®MTBDRsl установи мутации в gyrA гена при 100% от случаите с фенотипна резистентност към офлоксацин. Най-често срещаната мутация е A90V – 37,50%, следвана от D94G – 25%, D94A – 18,75%, S91P – 6,25% и други мутации – 12,50%. Мутации в rrs гена, отговорни за резистентността към аминогликозиди и циклични пептиди, бяха открити в 100% от случаите на фенотипна резистентност към инжекционните противотуберкулозни лекарствени средства, като в 100% от щамовете е установена мутацията А1401G.
Обсъждане:
Доказването на туберкулозата като MDR-TB или XDR-TB може да бъде осъществявано само с методите на микробиологията. Качествената микробиологична диагностика на MDR/XDR-TB определя навременната и адекватна терапия на пациентите, като по този начин може да бъде намалена трансмисията на тези тежки форми на туберкулозата сред населението.
Генетичните методи, използвани за скринингова и бърза диагностика (в рамките на 1-2 дни) на М. tuberculosis complex и резистентност към основните противотуберкулозни продукти, определят наличието или отсъствието на мутации, обуславящи резистентност към съответните групи лекарствени вещества. Не са редки случаите на резистентност, обусловена от други фактори, или други гени, невключени в комерсиалния тест. Поради тази причина конвенционалният тест за лекарствена чувствителност, базиращ се на определяне на фенотипната резистентност, остава стандарт за потвърждаване на MDR/ ХDR-TB както в България, така и в световен мащаб.
За първи път в България, през 2011г., НРЛ ТБ въведе тестове за лекарствена чувствителност за втори ред противотуберкулозни лекарства. Тя е единствената лаборатория у нас, сертифицирана от международни организации (INSTAND e.V. и WHO SRL TB) за осъществяването на фенотипните и генетични тестове за лекарствена чувствителност за първи и втори ред противотуберкулозни лекарства.
Заключение:
От проучените общо 324 щама в НРЛ ТБ, изолирани от пациенти за едногодишен период от време – през 2011г, на територията на цялата страна, изолатите на 68 пациента бяха доказани като MDR-TB.
Най-често срещаната мутация в rpoB гена, определяща резистентност към Рифампицин, е S531L – в 80,88%, за Изониазид в inhA гена – С15Т (39,70%) и в katG гена – S315T1 (33,82%) от проучените щамове.
От MDR-ТB щамовете – 13,23% са резистентни към Офлоксацин, 4,41% – резистентни към Aмикацин, Kанамицин и Kапреомицин, а 10,29% са с XDR-TB – към всички от тестваните втори ред противотуберкулозни лекарства.
Най-честата мутация в gyrA гена при резистентните към флуорохинолони е А90V (37,50%), а за резистентните към аминогликозиди и циклични пептиди мутацията А1401G в rrs гена се среща в 100% от случаите.
Направените изследвания бяха извършени благодарение на безвъзмездно предоставените консумативи, реактиви и тестове, по програми, финансирани от Глобалния Фонд за борба със СПИН, туберкулоза и малария: BUL-607-G02-T, BUL-809-G03-T
Литература:
- Rothschild B, Martin L, Lev G, et al, Mycobacterium tuberculosis complex DNA from an extinct bison dated 17,000 years before the present, Clin Infect Dis 33 2001 (3), 305–11
- Hershkovitz I, Donoghue HD, Minnikin DE et al, Detection and Molecular Characterization of 9000-Year-Old Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic Settlement in the Eastern Mediterranean, PLoS ONE 3 (10), 2008, e3426
- Zink A, Sola C, Reischl U, et al, Characterization of Mycobacterium tuberculosis complex DNAs from Egyptian mummies by spoligotyping J Clin Microbiol 2003 41 (1), 359–367.
- Tuberculosis through history. Encyclopædia Britannica
- Al-Sharrah, The Arab Tradition of Medical Education and its Relationship with the European Tradition Prospects 33 (4), 2003
- WHO, Global Tuberculosis Control: a short update to the 2010 report
- ECDC, WHO-Europe, 2010; Tuberculosis surveillance in Europe 2009
- Методично указание за терапевтично поведение при резистентна туберкулоза, МЗ, 2010
- WHO, Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis, Geneva, 2008, 237 p
- В. Миланов, М. Замфирова, Т. Върлева, и др., Епидемиологична и микробиологична характеристика на случаите с мултирезистентна туберкулоза в република България, регистрирани и съобщени за периода 2007– 2009г, Tоракална Медицина, т. III, бр.4., 2011
- WHO Global Task Force outlines measures to combat XDR-TB worldwide, 2006-10-21
- WHO, 2008, Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis, 237 pages, Geneva
- Методично указание за микробиологична диагностика и лечение на туберкулозата, МЗ, 2009
- Zhang Ying C.V. and William R. Jacobs, Mechanisms of Drug Resistance in Mycobaterium tuberculosis. ASM Press, Washington,D.C., 115-140 in S. T. C. e. al., ed. Tuberculosis and the Tubercle Bacillus.
- Hillemann, D., S. Rusch-Gerdes, and E. Richter, Evaluation of the GenoType MTBDRplus assay for rifampin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens. J Clin Microbiol 45:2635-2640,2007
- Hillemann, D., S. Rusch-Gerdes, and E. Richter, Feasibility of the GenoType MTBDRsl/ Assay for Fluoroquinolone, Amikacin-Capreomycin, and Ethambutol Resistance Testing of Mycobacterium tubercu/osis Strains and Clinical Specimens, J Clin Microbiol vol 47, No6,, 2009, p. 1767-1772
- WHO, Molecular Line Probe Assay for Rapid Screening of patients at risk of Multi-Drug resistent tuberculosis, (MDR-TB), Policy Statement , 27 June, 2008,1-9