Предизвикателства пред антимикробната терапия: резистентност и устойчивост

Резюме: Появата на резистентност към антимикробни средства е сериозен проблем за здравето на човека, което налага необходимостта от разработването на нови антимикробни препарати. Антибиотичната резистентност означава, че микроорганизмът  продължава да се развива дори и в присъствието на антибиотик поради специфични защитни механизми (например, ефлуксни помпи). Много от инфекциозните заболявания са трудни за третиране с антимикробни средства не поради развитието на резистентност, а поради „устойчивост“ (persisters неделящи се клетки). Разграничаването на тези два феномена е важно, тъй като за резистентните микроорганизми е необходимо прилагането на нов антимикробен агент. Благодарение на устойчивите микробни клетки се удължава продължителността на лечебния процес, което от своя страна увеличава риска от поява на резистентност. Като примери могат да се посочат бактериалните или микотични биофилми, латентната туберкулоза и пр. Устойчивите рersisters микроорганизми са фенотипни варианти на дивия тип клетки, т.е. чувствителна популация микроби без наличието на резистентни гени, които са в състояние да преживеят антимикробната терапия и при повторното си развитие да дадат дъщерна популация от чувствителни микроорганизми и нови персистери. Тази устойчивост може да възникне  спонтанно, независимо от наличието на антибиотици или от неблагоприятна околна среда (бедна на хранителни вещества), увреждане на ДНК, оксидативен стрес или quorum sensing (QS).

Ключови думи: резистентност, устойчивост, персистъри, quorum sensing.

Антимикробните препарати могат да бъдат получени от три източника: плесени или гъбички; бактерии; синтетични/полусинтетични съединения. Препа­ратите могат да са за локално или парентерално приложение и тяхното действие да е или бактериостатично (да инхибира растежа и размножаването на патогенните), или бактерициднo (да ги убива). Разграничаването на бактериостатичните от бактерицидните антибиотици (AБ) много често е трудно, т.к. зависи от концентрацията на антимикробното средство в мястото на инфекцията, минималната инхибиторна концентрация, фазата на развитие на микроорганизма и пр.¹. Действието на антимикробните средства е насочено към повлияването на някои жизнени процеси в бактериалните клетки или метаболизма². По този признак АБ могат да бъдат разделени на пет основни класа, а именно: инхибитори на синтеза на клетъчната стена (бета-лактами, гликопептиди), инхибитори на функцията на клетъчната мембрана (полимиксини), инхибиране на синтеза на протеини (аминогликозиди, хлорамфеникол, тетрациклини, макролиди, линкозамиди, оксазолидинони, кетолиди, стрептограмини), инхибиране синтеза на нуклеинови киселини (хинолони и флуорохинолони и рифамицини) и инхибиране на други метаболитни процеси като сулфонамиди и триметоприм. От посочените по-горе примери прави впечатление, че за действието на АБ е необходимо бактериите да са метаболитно активни, няма възможност да се въздейства на метаболитно неактивни форми, каквито са персистърите и спорите. Появата и разпространението на резистентни и полирезистентни микроорганизми е голямо предизвикателство за лечението на заболяванията, причинени от тях, което налага разработването и въвеждането в практиката на нови АБ^3,4,5. Независимо от нарасналите нужди за нови антимикробни средства, разработването на такива е ограничено и повечето от АБ, които използваме, са производни или модификации на съществуващи вече антибиотични класове⁶.

Ръстът на лекарствената резистентност (ЛР) означава, че хора с различни инфекции вече няма да могат да се лекуват ефективно, ще се появят епидемии, дължащи се на резистентни щамове, ще се увеличи продължителността на заболяванията, причинени от такива микроорганизми, ще се увеличи и смъртността. Резистентността е следствие на множество фактори, най-важните от които са прекомерната употреба, злоупотребата, неправилната употреба, използването на фалшиви лекарства⁷.

Най-честите механизми на лекарствена резистентност са:

- Модификация на антибиотика

Описани са много ензими, част от които инактивират АБ, каквито са β-лактамазите, други, които ги видоизменят, като аминогликозид-модифициращи ензими, chloramphenicol-ацетилтрансферази и др.

- Модификация на мишена

Тъй като взаимодействието на АБ с мишената му е доста специфично, дори малки промени в молекулярната структура на мишената могат да се отразят на свързването. Съществуват множество примери за модификация на антибиотичната мишена като механизъм за резистентност – erythromycin рибозомни метилази, водещи до резистентност на макролид-линкозамид-стрептограмини В (MLS_B)⁸; модификация в РВР (penicillin-свързващите протеини) може да повлияе афинитета на тези молекули към β-лактамните АБ, както бе описано вече за S.рneumonia⁹. Други важни примери за модификация на мишената са променените прекурсори за строежа на клетъчната стена, които са отговорни за резистентността на гликопептидни АБ; мутации в ДНК гиразата и топоизомераза ІV, даващи резистентност към флуорохинолони; рибозомна протекция срещу тетрациклини; мутации в РНК полимеразата, водещи до резистентност на rifampin.

- Ограничен достъп до мишената

Очевидно е, че за да бъде ефективен АБ, той трябва да достигне своята мишена. Всички Грам (-) бактерии имат външна мембрана, освен цитоплазмената. Намаляването на броя на порините (канали за придвижване на вещества през външната мембрана) е докладвано като важен механизъм на резистентност на imipenem при P. aeruginosa, на cefepime при E. cloacae и cefoxitin или ceftazidime в K. pneumoniae.  Бариерите за проникване могат да се създадат и в цитоплазмената мембрана. Например, придвижването на аминогликозидите през цитоплазмената мембрана е кислород-зависим процес и по тази причина те са неактивни в анаеробна среда.

- Ефлуксни помпи

Едни от най-проучваните напоследък механизми на резистентност са идентифицирането и характеризирането на ефлуксни помпи, изхвърлящи извън клетката един или повече класове антибиотици. По-голямата част са съсредоточени в цитоплазмената мембрана и са протонни помпи.

Една от характерните черти на бактериалните клетки е възможността им да изпадат в латентно състояние, при което всички процеси на растеж, развитие и размножаване се преустановяват. В това си състояние бактериите на практика не се повлияват от АБ, независимо от дозата, без да са развили някакъв тип резистентност. Преминавайки от латентно във  витално състояние, тези бактерии водят до възобновяване на симптоматиката на заболяването и при това те остават чувствителни на антибактериалните средства. Като следствие – протрахиране на заболяването, допълнително прилагане на АБ, повишен риск от развитие на резистентност. Това състояние на бактериите се определя като „persisters“ (устойчиви; такива, които преживяват). Такова протрахиране на  заболяването, наблюдаваме при различни форми на туберкулоза, бактериален ендокардит, инфектиране на екзематиди, рецидивиращите ангини и пр.¹⁰.

Разграничаването на резистентност и устойчивост е важно поради няколко факта, единият от които е, че за резистентните бактерии е необходимо разработването на нови антибактериални средства, докато за преодоляването на персистърите е необходим коренно различен подход.

За пръв път феноменът на устойчивост е описан от Hobby et al., който установява, че 1% от клетките на Staphylococcus aureus не са били убити от пеницилин, а са станали персистъри¹¹. Бактериите често преминават в състояние на метаболитна почивка, за да преодолеят нежеланите условия на околната среда. Дискутират се много теории за механизма на образуване на персистърните клекти. Някои обсъждат давността на инокулома, базирайки се на факта че в по-възрастен инокулум се откриват повече такива клетки. Други застъпват идеята, че степента на образуване на устойчиви клетки зависи от вида на използвания АБ, но засега най-много привърженици печели теорията на „токсин-антитоксин, ТА-модел“.

ТА системата се състои от стабилен токсин (винаги протеин), който потиска жизненоважни процеси в клетката(например, транслацията чрез разграждане на иРНК) и лабилен антидот (или РНК, или протеин)¹². В щамове E.coli, показващи висока устойчивост, е открита мутация (hipA7), отговорна за хиперпродукцията на токсина от този модел (hipBA). Токсин антитоксин (TA) модулите се кодират от двойка гени, обикновено намиращи се в един и същ оперон, като носителите могат да бъдат плазмиди или хромозоми. Само в хромозомата на Mycobacterium tuberculosis са открити петдесет такива модула. Свръхекспресията на токсина води до потискане растежа на клетките и невъзможност на антитоксина да се синтезира, което потвърждава ключовата роля на този модел при бактериалната устойчивост¹³.

Dörr и Lewisпредполагат, че клетката се опитва да направи най-малко две неща, когато е подложена на стрес¹⁴. Първото е да активира анти-стрес отговор, а второто е да пренастрои част от популацията в пасивно състояние, алтернативна стратегия, която позволява на тази част от популацията да се противопостави на стреса чрез бездействие. Доказано бе, че устойчивостта може да се индуцира от АБ, които в случая действат като екстрацелуларни стресови фактори. При изследването на този феномен се установи, че основен механизъм за образуването на персистъри е активирането на токсини.

Друг подход при разясняването на механизмите за устойчивост е изучаването на некултивируемите бактерии. Известно е, че много малка част около 1% от всичките видове бактерии могат да се култивират в лабораторни условия. Много изследвания показват, че за да се култивират in vitro некултивируемите микроорганизми, е необходимо добавянето на фактори, характерни за естествената им среда на развитие, както и добавянето на други видове микроорганизми. Това показва, че растежът им зависи от вещества или сигнални молекули, които дават информация за наличието на позната среда. Изводът е, некултивируемите микроорганизми преминават в пасивно състояние, когато попаднат в непозната среда. Такива некултивируеми клетки се наблюдават и при M. tuberculosis – спящи клетки. Тези клетки могат да се реанимират в течни хранителни среди в присъствието на активни микобактериални клетки (ефектът се дължи на вещество, секретирано от активните клетки – вещество, известно като бактериален растежен фактор „RPF“).

Някои публикувани наскоро изследвания показаха, че бактерицидните АБ, по различни механизми, увеличават продукцията на свободните радикали в клетките чрез реакцията на Фентън (формиране на хидроксилни радикали (-OH) от H₂O₂ в реакция, катализирана от метални йони (Fe2⁺ или Cu⁺). Следователно, толерантността към някои АБ може да се дължи на способност­та на клетката да се защитава от свободните радикали. Например, наблюдава се строго координиран отговор от страна на P. аeruginosa и E. coli, поставени в условия на липса на хранителни вещества, състоящ се в повишаване на антиоксидантната ензимна експресия и намаляване производството на прооксидативни молекули (антибиотична толерантност). В допълнение се наблюдава производство на азотен оксид (NO) и сероводород (H₂S), които водят до антибиотична толерантност чрез потискане на реакцията на Фентън.

Неделящи се клетки присъстват при повечено бактериални инфекции, особено в биофилмите, като пример – инфекциите на пикочните пътища при пациенти с катетри, където лекуването само с АБ е неефективно, ако не се смени катетърът. Устойчивостта на биофилма към антибиотично въздействие се дължи на персистърите, включени в матрикса на биофилма. АБ действат на метаболитно активните клетки, както свободните, така и включените в биофилма бактерии, клетките на имунната система атакуват свободните персистъри, но са безсилни към тези, включени в биофилма. След приключване на лечението персистърите преминават в активно състояние и инфекцията се възобновява. Такива инфекции са често срещани при пациенти с муковисцидоза, като най-чест бактериален причинител тук е Pseudomonas аeruginosa. Антибиотичното лечение е важна част от терапевтичния процес, но присъствието на устойчиви клетки усложнява и удължава терапевтичния процес. Подобни примери могат да се дадат и с редица други микробни причинители, MRSA, C.albicans, Plasmodium sp. и пр. Така персистърите играят важна роля за развитието на микробната резистентност. Установено е, че те могат да преминават от пасивно в активно състояние по време на лечението, като по този начин могат да бъдат междинно състояние в процеса на изграждане на резистентността. От друга страна, стрес-отговорите, които са от съществено значение за оцеляването на персистърите, ускоряват мутагенезата и хоризонталния пренос на гени.

Eдин от основните механизми за предаване на този тип резистентност е комуникацията между бактериите или т.н. „quorum sensing“ чрез използването на сигнални молекули „SOS“. По този начин се синхронизират действията на голям брой микроорганизми, като е важно да се подчертае, че тази синхронизация може да е не само между представителите на един и същ вид. Бактериите използват „quorum sensing“, за да координират например образуването на биофилм, вирулентността, отговора си на стресови ситуации, антибиотичната резистентност. Наскоро бе доказано и участието на сигнални молекули „SOS“ в стимулиране на хоризонталния пренос на гени при някои E. coli и V. chole­rae, предизвикана от хинолонова стимулация, като трансферът е на интегративни конюгативни елементи, носещи информация не само за хинолонова резистентност, а и за такава към аминогликозиди, линкозамиди и антифолатните АБ. Като допълнение, образуването на биофилм също насърчава хоризонталния пренос на гени.

Особено тежък е проблема при имунокомпроментираните индивиди. АБ, приложени в терапевтични дози, убиват голяма част от микроорганизмите, останалата част се елиминира от имунокомпетентните клетки. При имунокомпрометираните пациенти, в допълнение към тяхната увеличена  податливост към инфекции, персистерите, които обикновено се изчистват от макроорганизма, могат да причинят рецидив на инфекцията (HIV и рецидивираща туберкулоза). При много от пациентите с туморни заболявания е нарушен лигавичният имунитет, което води до рецидивиращи микотични инфекции, неподаващи се на локална терапия. При проучването на такива случаи бе доказано наличието на високи нива на персистъри сред представителите на C. glabrata и C. albicans¹⁶.

До момента не са регистрирани препарати, които да действат на метаболитно неактивни бактерии, но има данни за някои стари продукти с подобно действие. Установено бе, че пиразинамидът е по-активен срещу неразмножаващи се туберкулозни клетки, отколкото към размножаващи се¹⁷. Добавянето на moxifloxacin или gatifloxacin към основния режим от rifampicin, pyrazinamide и izoniazid ускорява убиването на метаболитно неактивни М. tuberculosis¹⁷. Друг пример е активността на rifampicin към персистъри на S. aureus. Ново производно на рифампина, rifalazil, показва многообещаваща активност, както към метаболитно активни, така и към персистъри на S. aureus, в комбинация с vancomycin. TG44, е друга разработка, атакуваща външната мембрана на Helicobacter рylori, показваща бактерицидна активност и към персистъри на този бактерий при рН 3-7.

При търсенето на нови антимикробни препарати фармацевтичната индустрия се ръководи от идеята за намирането на нови мишени, следвайки следните критерии:

• Да е различна от вече известните таргети.
• Да е жизненоважна за оцеляването на микробната клетка.
• Да е високо консервативна в клинично важните видове патогени.
• Да отсъства или да е различна при хората.
• Да е лесна за оценяване и измерване.
• Да е добре проучена (с установена химична природа и функции).

Новите мишени могат да бъдат ензими и протеини от жизненоважни биосинтетични пътища, като био­синтеза на протеини, РНК, мастните киселини, ароматни аминокиселини, клетъчната стена (сортаза), липид А, изопреноидна биосинтеза, ДНК репликация (GyrB субединица), глиоксалатен цикъл.

Белтъчна синтеза: пептид деформилаза (PDF). N-формил-метионин инициира белтъчната синтеза при бактериите, като тук е важно да отбележим, че отсъства при хората. Ензимите PDF и метионин-аминопептидаза отстраняват формил-метионина при зреенето на новосинтезираната полипептидна верига. Продукти с възможност за селективно инхибиране на PDF, са с потенциал за разработването на нов клас антимикробни препарати.

РНК-полимераза е ензим, който е необходим за транс­крибирането на генетичната информация от ДНК в РНК. Оприличава се на щипка на рак, където едното рамо е неподвижно, а другото се движи по веригата на ДНК. Новата мишена тук е подвижната връзка между двете рамена, а myxopyronin, corallopyronin и ribostatin са нови антибиотични молекули, които показват висока антимикробна активност, вкл. и към  M. tuberculosis.

Изопреноидите са голям клас разнообразни химични съединения, в частност липиди, прозиводни на пет въглеродния изопрен, чиито мономери са свързани и модифицирани по хиляди начини. Те участват  в синтезата на клетъчната стена, електронния транспорт, както и като структурни липиди в мембраната на бактериите. Биосинтезата на изопреноидите се извършва по няколко пътя, като по-интересен е немевалонатният път. Той се явява като източник не само на изопреноиди, но и на междинни метаболити за синтезата на тиамин и пиридоксал (прекурсор на вит. В₆) при много Грам(-) бактерии и протозои. Всичките 7 ензима, катализатори в този път, са атрактивни мишени за нови АБ. За момента само  Fosmidomycin е с доказан антибактериален ефект срещу Грам (+) и Грам (-) микроорганизми¹⁸.

Други потенциални мишени за синтез на нови АБ са факторите на вирулентност – адхезия, ефлуксни помпи, секреция на токсини, сигнални системи (двукомпонентна система (TCRs), QS), регулация на генната експресия на факторите на вирулентност. Предимствата при инхибирането на тези фактори са, че се избягва въздействието върху нормалната флора, а въздействието върху такива фундаментални фактори на вирулентността, като пили, продукция на токсини, QS, дава възможност за широкоспектърна активност.

Когато говорим за адхезия, трябва да сме наясно, че не съществуват универсални антиадхезини, поради факта, че в процеса на развитие на инфекцията патогените експресират различни адхезини за специфично място, в определено време и пр. Една от стратегиите е инактивиране на адхезията, която се извършва с помощта на пилите, като тук се инхибира биогенезата на пилите. Имайки предвид, че тип 1 пилите и Р-пилите се сглобяват с помощ­та на системата на шапероните, се заговори за антибиотичен клас PILICIDES – инхибитори на функцията на шапероните, някои представители от този клас са показани да потискат и формирането на биофилмите¹⁹.

Както се спомена и по-горе, „QS“  е система за координиране действията в бактериалната популация, като отговорите са изненадващо бързи, за което е отговорно индуцирането на определени гени. Тя играе също така и ключова роля в контрола на много метаболитни процеси в клетката, включително вирулентността и образуването на биофилм. Този начин за регулация на ген­ната експресия се базира на сигнални молекули с ниско молекулно тегло: автоиндуктори (Als), сензорна киназа и регулатори на отговора,  представляващи мишени за нови антибиотици. Проучени са 3 типа автоиндуктори: 1) ацилирани хомосерин лактони (AHL) – в много Грам (-) микроорганизми; 2) автоиндуциращи пептиди – къси пептиди или аминокиселини в Грам (+), екскретират се чрез АТФ-свързваща касетна експортна система (ABC); 3) съединения на автоиндуктор 2 (Al-2) – общи за Грам (+) и Грам (-), произлизат от фураноните. Сигналът се предава чрез многостепенно фосфорилиране на мембранно-свързаната протеин киназа. Като възможни антимикробни препарати се разглеждат както синтетични, така и естествени QS-инхибитори.

И така изправени сме пред едно голямо предизвикателство, наречено микробна резистентност. Предстоят ни години, през които представите ни за АБ като такива, които ги познаваме, ще се променят драстично.

Литература

1. Gootz TD. Discovery and development of new antimicrobial Agents. Clin.Microbiol. Rev. 3(1). 13-31. 1990.
2. Guardabassi L, Courvalin P. Modes of antimicrobial action and mechanisms of bacterial resistance: antimicrobial resistance in bacteria of animal origin. P: 1-18. 2006 FM Aarestrup, ed, ASM Press, Washington DC, USA.
3. Braine T. Bull. World Health Organ, 89. 88-89. 2011.
4. Bush K, Courvalin P, Dantas G, et al. Tackling antibiotic resistance. Nat. Rev. Microbiol. 9, 894-896. 2011.
5. Spellberg B, Blaser M, Guidos RJ, et al. Combating antimicrobial resistance: Policy recommendations to save lives. Clin. Infect. Dis, 52 (Suppl. 5), S397-S428. 2011.
6. Butler MS, Cooper MA. Antibiotics in the clinical pipeline in. J. Antibiot. (Tokyo). 64(6). 413-425. 2011.
7. Baquero F, Blàazquez J. Evolution of antibiotic resistance. Trends Ecol. Evol. 12(12). 482-487. 1997.
8. Weisblum B. 1995. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob. Agents Chemother. 39:577-585.
9. Hakenbeck R and  Coyette J. 1998. Resistant penicillin-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 54:332-340.
10. Coates AR, Hu Y. New strategies for antibacterial drug design:targeting non-multiplying latent bacteria. Drugs R. D. 7 133-151.2006
11. Hobby  GL,  Meyer K,  Chaffee E. Observations  on  themechanism of action of penicillin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 50.281-285. 1942.
12. Schuster  CF,  Bertram  R.  Toxin-antitoxin  systems  are ubiquitousand versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340. 73-85. 2013.
13. Falla TJ, Chopra I. Joint tolerance to beta-lactam and fluoroquinolone antibiotics in Escherichia coli results from overexpression of hipA. Antimicrob. Agents Chemother. 42. 3282-3284.1998
14. Dorr T, Vulic M, Lewis K. Ciprofloxacin causes persister formation by inducing the TisB toxin in Escherichia coli. PLoS Biol. 8, e1000317. 2010.
15. Wilson MC, Mori Т,  Rückert C, et al. An environmental bacterial taxon with a large and distinct metabolic repertoire. Nature 506. 58-62. 2014.
16. Lafleur MD, Qi Q, Lewis K. Patients with long-term oral carriage harbor high-persister mutants of Candida albicans.Antimicrob Agents Chemother.. 54. 39-44. 2010.
17. Hu Y, Coates AR, Mitchison DA. Sterilising action of pyrazinamide in models of dormant and rifampicin-tolerant Mycobacterium tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 10. 317-322. 2006.
18. Mak PA, Rao SPS, Tan MP, et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem. Biol. 7. 1190-1197. 2012.
19. Aberg V and Almqvist F.  Pilicides-small molecules targeting bacterial virulence. Org. Biomol. Chem. 5. 1827-1834. 2007.7-1834. 2007.