Антибиотиците и изкуството на войната

Брой № 2 (45) / април 2018, Белодробен микробиом и обоснована антибиотична терапия

Георги Момеков – Катедра по фармакология, фармакотерапия и токсикология, Фармацевтичен факултет при Медицински университет – София

 

Кореспонденция: проф. Георги Цв. Момеков, д.ф., Фармацевтичен факултет, МУ-София, ул. „Дунав“ 2, София 1000; gmomekov@gmail.com

 

 

Бактериалните инфекции, особено тези, причинени от резистентни щамове, представляват огромна глобална заплаха за общественото здраве1. Възможностите за ефективна ерадикация на патогенните микроорганизми и за куративно лечение на заболявания, които в миналото са били с тежка прогноза или неизменно фатални, бележи революционни промени не само в медицинската наука и практика, но и в демографските характеристики на обществата по света1,2. Така в продължение на десетилетия антимикробните лекарства (АМЛ) са били разглеждани като панацея за лечение на инфекции, независимо от факта, дали тяхното използване е целесъобразно или не и дали инфекцията е придобита в обществото или в болнична обстановка3.

 

Воденето на война с толкова древен, приспособим и генетично нестабилен враг обаче неминуемо води до преодоляване на ефективността на химическите ни оръжия, като в най-голяма степен това е свързано с развитието на резистентност, като за всички класове АМЛ са описани по няколко алтернативни механизма, с които те намаляват или напълно неутрализират действието на разработените от нас „бойни отровни вещества“ (Табл. 1)2,4-7. Повечето проблеми, свързани с устойчивостта на бактериите, се дължат на употреба и свръхупотреба на АМЛ за терапия и профилактика, като относителният дял на резистентните микроорганизми е най-голям в болниците. Употреба на АМЛ за ветеринарни цели и превенция също допринася за появата на резистентни патогенни щамове микроорганизми (40-50% от АМЛ, произвеждани ежегодно в световен мащаб, се добавят към фуража на селскостопански животни, източник на млечни и месни продукти за хранително-вкусовата промишленост)5. Налице е трайна, алармираща тенденция от последните десетилетия, възникването на нови щамове от резистентни бактерии да нараства, докато броят на новите, разрешени за употреба АМЛ, намалява драстично (Фиг. 1).

 

Фиг. 1. Трайно намаляване на броя нови АМЛ, разрешени за употреба от FDA, модифицирано по данни на Schäberle&Hack8

 

Тенденциите за нерационална употреба на тези лекарства са асоциирани с драстично нарастване на резистентните щамове, в т.ч. при патогени, които показват по принцип висока чувствителност към антибиотици. Допълнителна причина за възникване на антимикробна резистентност (АМР) е използването на хигиенни средства и дезинфектанти с triclosan или други антисептици. Доказателства за вредното въздействие върху човешкото здраве на масовата употреба на АМЛ са повишената честота на инфекциите, повишената честота на несполучливо лечение и появата на все по-тежки инфекции, както например човешки салмонелози, устойчиви на флуорохинолони. Днес AMР е сериозна заплаха за общественото здраве, която води до увеличаване на разходите за здравеопазване, неуспех на лечението и нарастване на смъртните случаи2,5,9.

 

За да посрещнат спешната необходимост от нови лекарства в борбата с проблемните патогени, изследователите продължават да изследват нови природни източници като морските ресурси, метагеномите на почвените екосистеми и некултивираните микроорганизми, които са напълно или в голяма степен непроучени в предходните скринингови програми за идентифициране на нови АМЛ10-15.

 

 

Усилията на учените в наши дни са насочени и към търсене и проучване на възможни нови мишени в бактериите, върху които биха могли да действат потенциалните АМЛ. Този стремеж се подпомага от програмите за разчитане на генома при редица микроорганизми, както и използваните досега техники, насочени към откриване на гените, отговорни за вирулентността и преживяемостта на бактериите5,9,16,17.

 

Новоразработените методи се основават на данните, според които във всяка фаза на един инфекциозен процес са необходими специфични вирулентни фактори, чиято експресия е най-често регулирана в условията, възникващи в гостоприемника при среща със специфичен патоген. През последните години завърши секвенирането на над 40 бактериални генома, вкл. на патогени като S. aureus, S. pneumoniae, M. tuberculosis, H. pylori, P. aeruginosa и V. cholerae. Белтъчните продукти на част от новооткритите гени съставят списъка от потенциални нови антибиотични мишени. Тяхното охарактеризиране на структурно ниво ще даде възможност за рационално откриване и разработване на нови молекули с антибиотичен потенциал (т. нар. молекулен дизайн). Използват се и подходи за получаване на библиотеки със синтетични компоненти и естествени продукти, съдържащи милиони представители или концентрирани около определени фармакофори9,17.

 

Интересен аспект, асоцииран с антибиотичното лечение, е взаимодействието с чревната флора3. Той обикновено се разглежда и нерядко се преекспонира през призмата на инхибиращите ефекти от страна на антибиотика и последващите дисбиоза, псевдомембранозен колит, нарушена продукция на метаболити от интестиналните коменсали, потискане на имунитета, както и разглеждането на микробиотата като източник на бактериална резистентност3.

 

Един изненадващ ракурс обаче е проучването на биологично-активните вещества, продуцирани от коменсалите в гастроинтестиналния тракт на човека като потенциални нови АМЛ16,18,19. Човешката микробиота (~ 100 трилиона микроби) представлява пълният набор от коменсални микроорганизми, включително бактерии, гъбички и вируси, които се намират в човешки тъкани и телесни течности, като кожа, белодробна тъкан и стомашно-чревния тракт. Човешкият микробиом (~ 8 милиона гена) кодира най-малко 100 пъти повече гени от целия човешки геном. Нашето познание за връзката между човека и неговата симбиотична микрофлора продължава да се променя, благодарение на нарастващия брой задълбочени изследвания на човешката микробиология. Все повече изследвания показват, че микробиотиците са от съществено значение за човешкото здраве като хранене, невробиология, имунология и различни заболявания като затлъстяване и диабет16.

 

С бързия напредък на човешкия микробиологичен проект многобройни проучвания показват, че човешкият микробиом е изключително разнообразен и динамичен. Независимо от това, противно на потомственото разнообразие на човешкия микробиом, се установява, че само микроорганизми произвеждат бактериоцини с антимикробни активности срещу тясно свързани бактерии16. През 2014 г. Donia и сътр. използваха систематичен подход чрез комбинация от комбинаторна химия, генетика, метагеномика и метатранскриптомика, за да идентифицират над 14 000 биосинтетични генни клъстери, отговорни за кодирането на 3118 молекули от геномите на човешкия микробиом19.

 

Тези данни недвусмислено показват, че човешкият микробиом представлява съществен и до голяма степен непроучен ресурс за идентифициране на нови антибиотици. Наскоро са идентифицирани тиопептидите, клас на рибозомно синтезирани антибиотици, които са широко разпространени в човешката микрофлора. Новият тиопептиден антибиотик, lactocillin, изолиран от вагиналната микрофлора, има силна антибактериална активност срещу редица грамположителни вагинални патогени16.

 

Наскоро от човешки симбионтни видове бяха изолирани нови перспективни биологично активни съединения – humimycin A, humimycin B и lugdunin18,20. Тези антибиотици се синтезират от генни клъстери NRPS (нерибозомална пептидна синтетаза) и се характеризират с широкоспектърна антибактериална активност, в т.ч. при проблемни, резистентни към конвенционалните средства патогени16.

 

Потенциалните АМЛ, които се разработват на основата на проучвания на човешкия микробиом и тяхната биологична активност, са обобщени накратко по-долу.

 

Бактериоцини

 

Бактериоцините са бактерицидни пептиди, секретирани от много разновидности на бактерии с цел елиминиране на конкуренцията в съответното местообитание, и са открити от Gratia през 1925. Независимо от това, че на този етап употребата на бактериоцините е ограничена до използването им като консерванти на хранителни продукти, тяхното проучване като потенциални лекарства е многообещаващо. Именно продукцията на бактериоцини обуславя способността на някои пробиотични микроорганизми да инхибират патогенни или условно патогенни бактериални видове17.

 

Бактериоцините са класифицирани в четири основни класа въз основа на тяхната структура и биологична активност: клас I (антибиотици) са малки (<5 kDa) термично устойчиви пептиди; клас II се състои от малки (<15 kDa), термично устойчиви, мембранно активни, немодифицирани пептиди; клас III се състои от термично лабилни протеини с размери над 15 kDa и клас IV се състои от бактериоцини със сложна химична структура, които имат липидни или въглехидратни остатъци17,21-25.

 

Повечето бактериоцини взаимодействат с клетъчната мембрана и променят свойствата й, което води до клетъчна смърт. Те са по-активни срещу Грам-положителни бактерии в сравнение с Грамотрицателните, тъй като външната им LPS-съдържаща мембрана предотвратява свободната дифузия на молекули с молекулна маса над 0.6 kDa, а най-малкият известен бактериоцин е 3 kDa. Някои бактериоцини, обаче, притежават способността да бъдат транспортирани с участието на транспортни протеини, експресирани по повърхността на външната мембрана (OmpF, FhuA), както и на вътрешната мембрана (SbmA, YejABEF, TonB) на Грам-отрицателните бактерии17.

 

Интимните молекулни механизми на бактериоцините върху клетъчната мембрана са разнообразни17,23-25. Някои от тях се свързват с молекулната „совалка“ липид-II, който е необходим за екстрацелуларния транспорт на пептидогликановите прекурсори през клетъчната мембрана, което в крайна сметка прекъсва синтезата на клетъчната стена и индуцира клетъчна смърт. Други бактериоцини образуват комплекс с липид-II, като формират пори в мембраните, което води до нарушаване на киселинно-алкалното и електролитното равновесие и промяна на мембранния потенциал. Бактериоцините, освен това, могат да повлияят навлизането на аминокиселини в клетките, да стимулират техния ефлукс, да предизвикат хидролиза или ефлукс на АТФ. Някои бактериоцини действат по механизъм, който не е насочен към клетъчната мембрана, като например такива с ендонуклеазна активност или със способност да лизират пептидогликана17. Потенциалните приложения на бактериоцините като АМЛ са обобщени на табл. 2.

 

 

Идентифицирани са бактериоцини, които действат срещу много важни човешки патогени. Те са активни по отношение на тесен спектър от бактерии, но основното им предимство е, че като цяло не засягат голяма част от естествената микрофлора на организма, в сравнение с конвенционалните антибиотици17.

 

Основен проблем, който възпрепятства успешното разработване на бактериоцините като лекарства, е бързото им разграждане под действието на протеолитични ензими. С оглед разрешаване на този проблем се разработват техни аналози с повишена протеолитична стабилност, както и лекарстводоставящи системи като полимерни наночастици и дендримери, които могат да предотвратят разграждането и да повишат бионаличността им в тъканите, засегнати от инфекция21,24.

 

„Убиващи фактори“

 

„Убиващите фактори“ (killing factors), се дефинират като антибактериални субстанции, освободени от бактериалните клетки, за да убиват сродни микроорганизми в условия на дефицит на нутриенти*,26-30. Това явление привлича интереса на научната общност, тъй като е аналог на канибализма при по-висшите видове и е най-добре охарактеризирано при B. subtilis, в т.ч. при щамове, изолирани от човешката микрофлора27-30. Геномът на тези бактерии съдържа набор от гени за „канибализъм“, които предизвикват лизис на наличните в средата му „събратя“ в условия на недостиг на хранителни вещества. Хранителните вещества, освободени от лизираните клетки, се използват от „убийците“ за оцеляване и образуване на спори27-29. Важно е да се отбележи, че B. subtilis предпочита да проявява „хищничество“, а не „канибализъм“, тоест преференциално лизира бактериалните клетки на други видове31. Видовете, които B. subtilis експлоатира като „жертви”, включват Е. coli, P. aeruginosa, A. lwoffi, X. campestrisи X. oryzae17. Тези особености на Bacilus subtilis се приписват на хетерогенността на ефектите на два пептида – протеина, забавящ спорообразуването и спорулационния убиващ фактор26,32. Ключова роля в регулацията на проявите на „хищничество/канибализъм“ играе сигналната молекула Spo0A. Тя е основен транскрипционен регулатор, асоцииран с образуването на био филм, спорулирането, както и с регулацията на синтеза на „убиващите фактори“. Клетките на B. subtilis, които не са влезли в цикъл на спорулиране (т.е., неактивен SpoOA), се лизират26-30.

 

Това, че отделеният от B. subtilis убиващ фактор е преференциално цитотоксичен към други видове бактерии, очертава огромния потенциал на тези биологично активни пептиди като АМЛ. Инхибиращите ефекти на различни наскоро идентифицирани убиващи фактори са оценени срещу различни човешки патогени, в т.ч. метицилин-резистентни S. aureus и опортюнистичния патоген S. epidermidis17.

 

От „Quorum sensing“ към „quorum quenching“

 

Господстващата догма, че микробите са едноклетъчни обекти, които не комуникират помежду си, отдавна е преразгледана, особено след откриването на т.нар. „усещане на кворума“ („Quorum sensing“). С този термин се означават възможностите на микробните клетки да комуникират, подобно на клетките на по-висш, многоклетъчен организъм, посредством сигнални молекули17,33-36. В много изследвания е наблюдавано, че микробната клетъчна комуникация играе жизненоважна роля по отношение появата на вирулентни характеристики и особено по отношение формирането на биофилми. На практика „Quorum sensing“ се осъществява с посредничеството на биологично активни вещества, които действат по два основни механизма. Първият тип „Quorum sensing“ e медииран от активиране на цитозолни транскрипционни фактори, които директно повлияват генната експресия, докато другият тип се предава посредством автоматично индуциране, т.е. активиране на мембранно локализирани рецептори, все механизми, които значително наподобяват действието на хормоните при висшите организми17. Микроорганизмът може да притежава един от двата вида „Quorum sensing“ системи или комбинация от тях17,35,36. Първият тип „Quorum sensing“ се медиира основно от ацилхомосеринови лактони (AHL), докато системата за автоматично индуциране включва различни биологично активни пептиди. Предполага се, че ако тази сигнална система бъде нарушена, вирулентността на микроорганизмите може да бъде контролирана без оказване на селективен натиск с възникване на резистентни микроорганизми. Този подход би позволил и да се инхибира пролиферацията и вирулентността на бактериите и е особено атрактивен по отношение избягване еволюцията на резистентни към лекарства щамове36.

 

Потискането на кворум-сигнализацията (quorum quenching) се осъществява чрез структурни аналози на „Quorum sensing“ сигналните молекули, които се конкурират със съответните биомолекули-мишени в бактериалните клетки или чрез инхибиране на ензимите, участващи в синтеза на тези медиатори (табл. 3). Така например антисептикът триклозан инхибира еноил-ACP редуктазата, която произвежда важно междинно съединение в биосинтезата на AHL. Друг подход за „Quorum sensing“-модулиране е основан на използването на ензими като AHL-лактоназа и AHL-ацилаза, които разрушават молекулата на хомосериновите лактони и така ги инактивират17,36.

 

 

Основното предимство на използването на „Quorum sensing“-инхибиторите е, че те ограничават еволюцията на резистентни щамове, тъй като не са бактерицидни и не упражняват селективен натиск. Както вирулентността, така и образуването на биофилм изискват сигнална комуникация. Инхибирането на същите повишава чувствителността към АМЛ и това може да се разглежда като допълнително предимство, тъй като биофилмите като правило са по-слабо чувствителни към антибиотици от планктонните форми на същия патоген. Това обуславя огромния интерес към проучване на подходите за модулация, в т.ч. с инхибитори, изолирани от нормалната флора17.

 

Послания към клинициста

 

1. Експлоатирането на химичното разнообразие на вторични метаболити, продуцирани от човешката микробиота като източник на нови потенциални АМЛ, е в пеленаческа фаза.

 

2. Преместването на фокуса от лечение с цитотоксични за бактериите вещества към диверсионни кампании, целящи превръщането на хищниците в жертви на канибализъм или нарушаване на телекомуникациите между щаба и фронтовата линия на врага са от голям интерес и то не само за академичната общност.

 

3. Бързото идентифициране на интересни в структурно и фармакологично отношение съединения е обнадеждаващо, още повече, че някои от тях са с нови механизми на действие, които позволяват комбинирането им с конвенционалните антибиотици и така не способстват за развитие на АМР.

 

4. Воденето на война с опортюнистичен противник със сигурност изисква гъвкаво и неконвенционално поведение.

 

* Фратрицид – прокариотно братоубийство, по-древно от библейското.

 

Литература:

 

1. Toone EJ. Bacterial infection remains a leading cause of death in both Western and developing world. Preface. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 2011; 77: xi-xiii.

2. Smith A, Bagg J. An update on antimicrobial chemotherapy: 2. The mechanisms of antibiotic resistance. Dent Update 1998; 25(5): 203-4, 6-8.

3. Brunton L, Chabner BA, Knollman B. Goodman and Gilman’s. The Pharmacological Basis of Therapeutics, Twelfth Edition: McGraw-Hill Education; 2011.

4. Nguyen L. Antibiotic resistance mechanisms in M. tuberculosis: an update. Arch Toxicol 2016; 90(7): 1585-604.

5. Rossolini GM, Arena F, Pecile P, Pollini S. Update on the antibiotic resistance crisis. Curr Opin Pharmacol 2014; 18: 56-60.

6. Li XZ, Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update. Drugs 2009; 69(12): 1555-623.

7. Walsh C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 2000; 406(6797): 775-81.

8. Schäberle TF, Hack IM. Overcoming the current deadlock in antibiotic research. Trends in Microbiology; 22(4): 165-7.

9. Brown ED, Wright GD. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature 2016; 529(7586): 336-43.

10. Newman DJ, Cragg GM. Endophytic and epiphytic microbes as „sources” of bioactive agents. Front Chem 2015; 3: 34.

11. Cragg GM, Newman DJ. Natural products: a continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta 2013; 1830(6): 3670-95.

12. Newman D, Cragg G. Natural products in medicinal chemistry. Bioorg Med Chem 2009; 17(6): 2120.

13. Newman DJ, Cragg GM, Battershill CN. Therapeutic agents from the sea: biodiversity, chemo-evolutionary insight and advances to the end of Darwin’s 200th year. Diving Hyperb Med 2009; 39(4): 216-25.

14. Newman DJ, Cragg GM. Natural product scaffolds as leads to drugs. Future Med Chem 2009; 1(8): 1415-27.

15. Newman DJ, Cragg GM. Marine natural products and related compounds in clinical and advanced preclinical trials. J Nat Prod 2004; 67(8): 1216-38.

16. Xiong ZQ. The Human Microbiome as a New Source for Antibiotic Discovery.  . Clin Microbiol 2016; 5:e137.: doi: 10.4172/2327-5073.1000e137.

17. Nigam A, Gupta D, Sharma A. Treatment of infectious disease: beyond antibiotics. Microbiol Res 2014; 169(9-10): 643-51.

18. Chu J, Vila-Farres X, Inoyama D, et al. Discovery of MRSA active antibiotics using primary sequence from the human microbiome. Nature Chemical Biology 2016; 12: 1004.

19. Donia MS, Cimermancic P, Schulze CJ, et al. A systematic analysis of biosynthetic gene clusters in the human microbiome reveals a common family of antibiotics. Cell 2014; 158(6): 1402-14.

20. Zipperer A, Konnerth MC, Laux C, et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature 2016; 535(7613): 511-6.

21. Riley MA. Molecular mechanisms of bacteriocin evolution. Annu Rev Genet 1998; 32: 255-78.

22. Israil AM. Recent data concerning bacteriocin-bacteriophage interrelationship. Arch Roum Pathol Exp Microbiol 1986; 45(3-4): 175-221.

23. Govan JR. In vivo significance of bacteriocins and bacteriocin receptors. Scand J Infect Dis Suppl 1986; 49: 31-7.

24. Delves-Broughton J, Blackburn P, Evans RJ, Hugenholtz J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek 1996; 69(2): 193-202.

25. Bierbaum G, Sahl HG. Lantibiotics–unusually modified bacteriocin-like peptides from gram-positive bacteria. Zentralbl Bakteriol 1993; 278(1): 1-22.

26. Lamsa A, Liu WT, Dorrestein PC, Pogliano K. The Bacillus subtilis cannibalism toxin SDP collapses the proton motive force and induces autolysis. Mol Microbiol 2012; 84(3): 486-500.

27. Hofler C, Heckmann J, Fritsch A, et al. Cannibalism stress response in Bacillus subtilis. Microbiology 2016; 162(1): 164-76.

28. Gonzalez-Pastor JE, Hobbs EC, Losick R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science 2003; 301(5632): 510-3.

29. Gonzalez-Pastor JE. Cannibalism: a social behavior in sporulating Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev 2011; 35(3): 415-24.

30. Claverys JP, Havarstein LS. Cannibalism and fratricide: mechanisms and raisons d’etre. Nat Rev Microbiol 2007; 5(3): 219-29.

31. Nandy SK, Bapat PM, Venkatesh KV. Sporulating bacteria prefers predation to cannibalism in mixed cultures. FEBS Lett 2007; 581(1): 151-6.

32. Perez Morales TG, Ho TD, Liu WT, et al. Production of the cannibalism toxin SDP is a multistep process that requires SdpA and SdpB. J Bacteriol 2013; 195(14): 3244-51.

33. Utari PD, Vogel J, Quax WJ. Deciphering Physiological Functions of AHL Quorum Quenching Acylases. Front Microbiol 2017; 8: 1123.

34. Rice SA, McDougald D, Kumar N, Kjelleberg S. The use of quorumsensing blockers as therapeutic agents for the control of biofilm-associated infections. Curr Opin Investig Drugs 2005; 6(2): 178-84.

35. Rasmussen TB, Givskov M. Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects. Microbiology 2006; 152(Pt 4): 895-904.

36. Rasmussen TB, Givskov M. Quorum-sensing inhibitors as anti-pathogenic drugs. Int J Med Microbiol 2006; 296(2-3): 149-61.


 

Вашият коментар